*CN101921481A*
(10)申请公布号 CN 101921481 A(43)申请公布日 2010.12.22
(12)发明专利申请
(21)申请号 201010237837.X(22)申请日 2010.07.27
(71)申请人北京化工大学
地址100029 北京市朝阳区北三环东路15
号(72)发明人谭天伟 张睿
(74)专利代理机构北京鼎佳达知识产权代理事
务所(普通合伙) 11348
代理人王伟锋(51)Int.Cl.
A61L 27/20(2006.01)A61L 27/18(2006.01)A61L 27/52(2006.01)A61L 31/10(2006.01)A61L 31/14(2006.01)A61K 47/36(2006.01)A61K 47/34(2006.01)
C08L 79/08(2006.01)C08L 5/08(2006.01)C08J 3/24(2006.01)C08J 3/075(2006.01)C08B 37/08(2006.01)C08G 73/10(2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 6 页
(54)发明名称
透明质酸和聚天门冬氨酸原位交联型凝胶及其制备方法(57)摘要
本发明公开了一种透明质酸和聚天门冬氨酸原位交联型凝胶及其制备方法。具体步骤为：以透明质酸和聚琥珀酰亚胺为原料，用氧化剂氧化透明质酸制备得到具有双醛基团的透明质酸衍生物，用双胺类物质接枝改性聚琥珀酰亚胺得到具有双胺基团的聚天门冬氨酸衍生物，将两种高聚物衍生物分别溶解在缓冲液中，将两者混合，通过缩合反应使其凝胶化，本发明的优点为制备工艺简单，反应过程温和、凝胶化时间短且可控制，凝胶制备过程中无需使用交联剂、制备得到的水凝胶性能稳定、生物相容性好、生物可降解，可以通过注射的手段用于组织工程、栓塞材料和药物缓释领域。
CN 101921481 ACN 101921481 ACN 101921482 A
权 利 要 求 书
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1.一种透明质酸和聚天门冬氨酸原位交联型凝胶，其特征在于由具有双醛结构的透明质酸和具有双胺基团的聚天门冬氨酸之间的缩合反应制得，可由下述方法得到：透明质酸衍生物和聚天门冬氨酸衍生物分别按照质量百分比1～10％溶解在缓冲液中，在10～50℃下将透明质酸衍生物和聚天门冬氨酸衍生物溶液按比例4∶(1～16)混合反应，所述缓冲液的pH值范围为5.0～8.0，离子浓度为0.01～0.5mol/L，反应温度为10～50℃，凝胶化时间为10秒～30分钟。
2.如权利要求1所述一种透明质酸和聚天门冬氨酸原位交联型凝胶的制备方法，包括如下步骤：透明质酸衍生物和聚天门冬氨酸衍生物分别按照质量百分比1～10％溶解在缓冲液中，在10～50℃下将透明质酸衍生物和聚天门冬氨酸衍生物按4∶(1～16)混合反应，所述缓冲液的pH值为5.0～8.0，离子浓度为0.01～0.5mol/L，温度为10～50℃。
3.如权利要求2所述一种透明质酸和聚天门冬氨酸原位交联型凝胶的制备方法，其特征在于所述透明质酸衍生物的制备方法如下：将透明质酸溶解在水中，在温度为0～50℃的条件下，加入氧化剂氧化透明质酸1～24h，再用乙二醇终止反应，再将混合物用水透析3天，冻干得到透明质酸衍生物。
4.如权利要求2所述一种透明质酸和聚天门冬氨酸原位交联型凝胶的制备方法，其特征在于所述氧化剂为高锰酸钾、高碘酸钠、双氧水，氧化剂与透明质酸的质量比例为5∶(1～25)，所述氧化反应温度范围为10～50℃，氧化反应时间为1～24h。
5.如权利要求2所述一种透明质酸和聚天门冬氨酸原位交联型凝胶的制备方法，其特征在于所述缓冲液为柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、模拟人工体液或人工泪液；缓冲液中无机盐的种类为氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾。
6.如权利要求2所述一种透明质酸和聚天门冬氨酸原位交联型凝胶的制备方法，其特征在于所述凝胶化时间为10秒～30分钟。
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说 明 书
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透明质酸和聚天门冬氨酸原位交联型凝胶及其制备方法
技术领域
[0001]
本发明属于水凝胶系列，涉及以透明质酸和聚天门冬氨酸制备的原位交联型凝
胶。
背景技术
[0002] 水凝胶是亲水性的交联高分子网络与被其包裹的水构成的一种特殊的分散体系。这种材料具有三维网络结构，能保持一定的形状，且含有大量的水份，柔软而类似生物体组织，不容易造成组织损伤，目前被广泛地应用在生物医学领域中。[0003] 近年来，原位交联型凝胶材料引起了人们的特别关注。这种可流动的水凝胶原液注射到目标位置后，很容易充满整个具有不规则形状的缺损部位，并能在目标位置迅速凝胶化形成不可流动、维持一定形态的水凝胶。而且通过注射的方法可避免手术创伤性，整个操作简易方便。
[0004] 天然高分子如透明质酸、壳聚糖、明胶、聚氨基酸、甲基纤维素、海藻酸钠等都可用于制备原位交联型凝胶。透明质酸是一种天然的聚合物，具有一些独特的性能，这些性能使得它成为生化和医药的良好材料。透明质酸广泛分布于体内，作为细胞外基质的组成部分负责组织间的连接，而且HA在软骨组织的稳定、细胞增殖、形态发生的控制、恶性肿瘤的转移、发炎过程和伤口的愈合等方面起着重要作用。透明质酸分子用于人体器官时不会被免疫系统当做外来物质，而且不会引发炎症反应或者毒性反应。除此之外，它的生物相容性，物理化学性能也使得HA能够很好的用于药物释放、组织工程以及骨关节炎治疗的防粘连等。聚天冬氨酸(PASP)属于聚氨基酸中的一类。聚天冬氨酸因其结构主链上的肽键易受微生物、真菌等作用而断裂，最终降解产物是对环境无害的氨、二氧化碳和水。因此，聚天冬氨酸是生物降解性好的、环境友好型化学品。聚天冬氨酸用途广泛。在水处理、医药、农业、日化等领域都能找到它的用途。[0005] 2007年，G.Pitarresi(Preparation and characterization of new hydrogels basedon hyaluronic acid and α，β-polyaspartylhydrazide，European Polymer Journal，43(2007))制备了一种透明质酸-聚天冬酰肼水凝胶，它以透明质酸和聚天冬酰肼为原料，以1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳酰亚胺为交联剂，在pH＝4.0的水相中实现透明质酸与聚天冬酰肼之间的交联，生成水凝胶。其缺点在于反应需使用到交联剂，降低了凝胶体系的生物相容性；且凝胶化反应时间较长，不能实现原位交联，了凝胶的应用。[0006] 已报道的原位交联型水凝胶往往依靠天然大分子的物理性能或其离子键、静电作用力或疏水作用力实现溶液-胶体之间的转化。如Molly S.Shoichet(Fast-gelling
localized injectableblend of hyaluronan and methylcellulose for intrathecal，
delivery to theinjured spinal cord，Biomaterials，27(2006))报道了一种可实现快速凝胶化的透明质酸-甲基纤维素水凝胶，它利用甲基纤维素具有温敏性实现凝胶化。其缺点在于这种溶液-胶体之间的转化是可逆的，会导致水凝胶性能不稳定，极大程度上其在生物领域的应用。
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说 明 书
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鉴于此，我们利用改性后具有双醛结构的透明质酸和具有双胺基团的聚天门冬氨酸之间的缩合反应制备出性能稳定的原位交联型水凝胶。发明内容
本发明要解决的技术问题是制备一种工艺简单、无需使用交联剂、凝胶化时间短
且可控制、性能稳定且生物相容性好的原位交联型水凝胶及其制备方法。
[0009] 本发明产品透明质酸和聚天门冬氨酸原位交联型凝胶由具有双醛结构的透明质酸和具有双胺基团的聚天门冬氨酸之间的缩合反应制得，可由下述方法得到：透明质酸衍生物和聚天门冬氨酸衍生物分别按照质量百分比1～10％溶解在缓冲液中，再将透明质酸衍生物与聚天门冬氨酸衍生物溶液按4∶(1～16)的比例混合反应，所述缓冲液的pH值范围为5.0～8.0，离子浓度为0.01～0.5mol/L，反应温度为10～50℃，凝胶化时间为10秒～30分钟。
[0010] 本发明透明质酸和聚天门冬氨酸原位交联型凝胶的制备方法如下：
[0011] 透明质酸衍生物和聚天门冬氨酸衍生物分别按照质量百分比1～10％溶解在缓冲液中，再将透明质酸衍生物和聚天门冬氨酸衍生物按4∶(1～16)的比例混合反应，所述缓冲液的pH值范围为5.0～8.0，离子浓度为0.01～0.5mol/L，反应温度为10～50℃，凝胶化时间为10秒～30分钟。
[0012] 透明质酸衍生物的制备方法如下：将透明质酸溶解在水中，在温度为0～50℃的条件下，加入氧化剂氧化透明质酸1～24h，再用乙二醇终止反应，再将混合物用水透析3天，冻干得到具有双醛基团的透明质酸衍生物；
[0013] 所述的透明质酸按质量百分比0.1～5％溶解在pH值范围为2～7的水中。过低或过高的透明质酸溶液浓度，都会影响到氧化剂在溶液中的分散，溶液浓度过低会导致得到的产物分子量过低，溶液浓度过高从而导致得到的产物醛含量过低；溶剂的pH值要控制在2～7之间，过低的pH值会导致透明质酸的降解，过高的pH值会降低氧化剂的氧化效果。
[0014] 透明质酸衍生物的制备所用水优选去离子水。[0015] 所述的氧化剂为高锰酸钾、高碘酸钠、双氧水，氧化剂与透明质酸的质量比例为5∶(1～25)。氧化剂的用量的多少直接到影响产物的醛含量和分子量，氧化剂的用量过少，得到的产物醛含量过低，在第三步的交联反应中，会降低交联速度，得到的凝胶交联度低且易降解；氧化剂的用量过多，得到的反应副产物增加，目标产物的分子量则会降低。[0016] 所述的氧化反应温度范围优化为10～50℃，氧化反应时间为1～24h。透明质酸是一种多糖结构，耐受温度范围较窄，若反应温度超过50℃，透明质酸易被降解；氧化反应时间与氧化剂的选择有关。
[0017] 聚天门冬氨酸衍生物制备方法：将聚琥珀酰亚胺溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，在温度为-10～80℃的条件下，用双胺类物质中的胺基进攻聚琥珀酰亚胺中的酰亚胺键使其开环，接枝改性聚琥珀酰亚胺，反应时间为1～12h，生成的产物以沉淀的方式从溶剂中析出，再将沉淀物溶解于去离子水，经超滤冻干得到具有双胺基团的聚天门冬氨酸衍生物；[0018] 所述的双胺类物质为C2～8的二胺、水合肼或赖氨酸，双胺类物质与聚琥珀酰亚胺的质量比例优化为5∶(1～25)。过高的双胺类物质与聚琥珀酰亚胺的质量比例将导致
[0008]
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聚琥珀酰亚胺的交联，此时，双胺类物质不仅仅是接枝物，而是起到了交联剂的作用。接枝反应得到的产物是具有双胺基团的聚天门冬氨酸衍生物。
[0019] 透明质酸衍生物和聚天门冬氨酸衍生物分别按照质量百分比1～10％溶解在缓冲液中。随着质量百分比的增加，凝胶的凝胶化时间随之缩短，生成的凝胶空间网络结构更加紧凑，抗降解性能也随之提高；但当质量百分比过高时，溶液粘稠度显著增大，从而导致两种大分子上的官能团不能完全交联，生成的凝胶交联度降低，空间网络结构变疏松，抗降解性能下降。
[0020] 所述缓冲液为柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、模拟人工体液、人工泪液。不同的缓冲液可以提供不同的pH值缓冲范围。[0021] 所述缓冲液的pH值范围控制为5.0～8.0，缓冲液中无机盐的种类为氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾，其离子浓度控制为0.01～0.5mol/L。缓冲液的pH值以及离子浓度是凝胶化时间长短的决定性因素，也影响了凝胶的理化性能。
[0022] 所述的透明质酸衍生物及聚天门冬氨酸衍生物缓冲溶液按4∶(1～16)的比例混合反应，任何一种高聚物衍生物过量都会延长凝胶化时间，造成凝胶网络结构的不完整，降低凝胶的抗降解性能。
[0023] 所述的反应温度优化为10～50℃，过高过低的反应温度都会对凝胶性能造成影响。水是此反应的唯一副产物，被包裹在水凝胶中。
[0024] 本发明的透明质酸和聚天门冬氨酸原位交联型凝胶制备过程反应方程式如下：
[0025]
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本发明制备工艺简单，反应过程温和。首先通过用氧化剂氧化透明质酸得到具有双醛基团的透明质酸衍生物，再利用双胺类物质中的胺基进攻聚琥珀酰亚胺中的酰亚胺键，使其开环生成具有双胺基团的聚天门冬氨酸衍生物，最后，将两种高聚物衍生物分别溶解在同一种缓冲液中，将两者混合使其凝胶化。氧化反应过程中，可通过透明质酸的浓度、溶剂的pH值、氧化剂的选择及用量、反应温度及反应时间来控制产物的醛含量和分子量；接枝反应过程中，可通过二胺类物质的选择及用量、反应温度及时间来控制产物的接枝率；凝胶化反应过程中，可通过缓冲液种类及其pH值、溶剂中离子的种类和强度调节控制凝胶化时间和凝胶的性能。
[0027] 透明质酸衍生物上的醛基与聚天门冬氨酸衍生物上的胺基之间发生缩合反应，实现溶液-胶体之间的转变，交联制备出透明质酸-聚天门冬氨酸原位交联型水凝胶。整个凝胶化过程无需使用交联剂、凝胶化时间短且可通过缓冲液种类及其pH值、溶剂中离子的种
[0026]
类和强度的调节实现控制，水是此缩合反应的唯一副产物，被包裹在水凝胶中，制备得到的水凝胶性能稳定、生物相容性好、生物可降解，适用于组织工程，栓塞材料或药物缓释领域。[0028] 具体实施方式：下面通过具体的实施方案叙述本发明中透明质酸和聚天门冬氨酸原位交联型凝胶及其制备方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的培养剂组分、含量、培养条件、分离提取条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
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以下给出本发明的实施例，进一步对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。[0030] 实施例1
[0031] 称取0.1g透明质酸(分子量为1,200KDa)溶于50ml pH为3.0的去离子水中，待透明质酸溶解完毕后加入0.5g双氧水，在20℃搅拌反应12h，反应完毕后加入20ml乙二醇终止反应，再将混合物透析3天去除乙二醇等小分子物质，冷冻干燥得到具有双醛基团的透明质酸衍生物，产物醛基含量为33.28％，分子量为390KDa。[0032] 称取1g聚琥珀酰亚胺溶解于100ml N，N-二甲基甲酰胺中，加入1g己二胺，在40℃水浴搅拌反应12h，期间会有沉淀产生。反应结束后过滤收集沉淀物，将沉淀物再次溶解于100ml去离子水中，经过超滤去除未反应的小分子，冻干收集得具有双胺基团的聚天门冬氨酸衍生物。
[0033] 称取0.02g透明质酸衍生物和0.02g聚天门冬氨酸衍生物分别溶解于1ml磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH＝6.4，浓度为0.2mol/L)中，待其完全溶解后，将1ml透明质酸衍生物溶液和0.5mL聚天门冬氨酸衍生物溶液用漩涡震荡混合均匀，再放置于20℃水浴中恒温，静止制得水凝胶。凝胶化时间为8min 51.78s。[0034] 实施例2
[0035] 称取0.2g透明质酸(分子量为1,200KDa)溶于50ml pH为5.0的去离子水中，待透明质酸溶解完毕后加入0.3g双氧水，在30℃搅拌反应8h，反应完毕后加入20ml乙二醇终止反应，再将混合物透析3天去除乙二醇等小分子物质，冷冻干燥得到具有双醛基团的透明质酸衍生物，产物醛基含量为39.56％，分子量为460KDa。[0036] 称取1g聚琥珀酰亚胺溶解于50ml N，N-二甲基甲酰胺中，加入1g戊二胺，在40℃水浴搅拌反应12h，期间会有沉淀产生。反应结束后过滤收集沉淀物，将沉淀物再次溶解于100ml去离子水中，经过超滤去除未反应的小分子，冻干收集得具有双胺基团的聚天门冬氨酸衍生物。
[0037] 称取0.03g透明质酸衍生物和0.03g聚天门冬氨酸衍生物分别溶解于1ml磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH＝6.0，浓度为0.2mol/L)中，待其完全溶解后，将0.5ml透明质酸衍生物溶液和1mL聚天门冬氨酸衍生物溶液用漩涡震荡混合均匀，再放置于30℃水浴中恒温，静止制得水凝胶。凝胶化时间为5min 34.83s。[0038] 实施例3
[0039] 称取0.1g透明质酸(分子量为1,200KDa)溶于50ml pH为3.0的水溶液中，待透明质酸溶解完毕后加入0.2g高碘酸钠，在40℃搅拌反应2h，反应完毕后加入20ml乙二醇终止反应，再将混合物透析3天去除乙二醇等小分子物质，冷冻干燥得到具有双醛基团的透明质酸衍生物，产物醛基含量为22.47％，分子量为630KDa。[0040] 称取1g聚琥珀酰亚胺溶解于100ml N，N-二甲基甲酰胺中，加入1g赖氨酸，在40℃水浴搅拌反应12h，期间会有沉淀产生。反应结束后过滤收集沉淀物，将沉淀物再次溶解于100ml去离子水中，经过超滤去除未反应的小分子，冻干收集得具有双胺基团的聚天门冬氨酸衍生物。
[0041] 称取0.01g透明质酸衍生物和0.01g聚天门冬氨酸衍生物分别溶解于1ml柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液(pH＝6.0，浓度为0.2mol/L)中，待其完全溶解后，将1ml透明质酸衍生物溶液和1mL聚天门冬氨酸衍生物溶液用漩涡震荡混合均匀，再放置于30℃水浴
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中恒温，静止制得水凝胶。凝胶化时间为12min 44.21s。[0042] 实施例4
[0043] 称取0.1g透明质酸(分子量为1,200KDa)溶于50ml pH为4.0的水溶液中，待透明质酸溶解完毕后加入0.5g高碘酸钠，在10℃搅拌反应8h，反应完毕后加入20ml乙二醇终止反应，再将混合物透析3天去除乙二醇等小分子物质，冷冻干燥得到具有双醛基团的透明质酸衍生物，产物醛基含量为42.16％，分子量为270KDa。[0044] 称取1g聚琥珀酰亚胺溶解于100ml N，N-二甲基甲酰胺中，加入1g己二胺，在40℃水浴搅拌反应12h，期间会有沉淀产生。反应结束后过滤收集沉淀物，将沉淀物再次溶解于100ml去离子水中，经过超滤去除未反应的小分子，冻干收集得具有双胺基团的聚天门冬氨酸衍生物。
[0045] 称取0.05g透明质酸衍生物和0.05g聚天门冬氨酸衍生物分别溶解于1ml Tris-盐酸缓冲液(pH＝7.4，浓度为0.1mol/L)中，待其完全溶解后，将0.3ml透明质酸衍生物溶液和0.9mL聚天门冬氨酸衍生物溶液用漩涡震荡混合均匀；再放置于30℃水浴中恒温，静止制得水凝胶。凝胶化时间为3min 56.11s。[0046] 实施例5
称取0.1g透明质酸(分子量为1,200KDa)溶于50ml pH为5.0的水溶液中，待透
明质酸溶解完毕后加入0.3g高锰酸钾，在30℃搅拌反应4h，反应完毕后加入20ml乙二醇终止反应，再将混合物透析3天去除乙二醇等小分子物质，冷冻干燥得到具有双醛基团的透明质酸衍生物，产物醛基含量为56.76％，分子量为680KDa。[0048] 称取1g聚琥珀酰亚胺溶解于100ml N，N-二甲基甲酰胺中，加入1g水合肼，在40℃水浴搅拌反应12h，期间会有沉淀产生。反应结束后过滤收集沉淀物，将沉淀物再次溶解于100ml去离子水中，经过超滤去除未反应的小分子，冻干收集得具有双胺基团的聚天门冬氨酸衍生物。
[0049] 称取0.08g透明质酸衍生物和0.08g聚天门冬氨酸衍生物分别溶解于1ml人工泪液(pH＝7.4，浓度为0.05mol/L)中，待其完全溶解后，将1ml透明质酸衍生物溶液和0.5mL聚天门冬氨酸衍生物溶液用漩涡震荡混合均匀，再放置于30℃水浴中恒温，静止制得水凝胶。凝胶化时间为45.13s。[0050] 实施例6
[0051] 称取0.1g透明质酸(分子量为1,200KDa)溶于50ml pH为5.0的水溶液中，待透明质酸溶解完毕后加入0.3g高锰酸钾，在30℃搅拌反应4h，反应完毕后加入20ml 乙二醇终止反应，再将混合物透析3天去除乙二醇等小分子物质，冷冻干燥得到具有双醛基团的透明质酸衍生物，产物醛基含量为56.76％，分子量为680KDa。[0052] 称取1g聚琥珀酰亚胺溶解于100ml N，N-二甲基甲酰胺中，加入1g戊二胺，在40℃水浴搅拌反应12h，期间会有沉淀产生。反应结束后过滤收集沉淀物，将沉淀物再次溶解于100ml去离子水中，经过超滤去除未反应的小分子，冻干收集得具有双胺基团的聚天门冬氨酸衍生物。
[0047] [0053]
称取0.10g透明质酸衍生物和0.10g聚天门冬氨酸衍生物分别溶解于1ml模拟人
工体液(pH＝7.4，浓度为0.2mol/L)中，待其完全溶解后，将1ml透明质酸衍生物溶液和1mL聚天门冬氨酸衍生物溶液用漩涡震荡混合均匀，再放置于30℃水浴中恒温，静止制得
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