促黄体生成激素释放激素拮抗类似物的分离纯化研究

２０（１９年第１８卷第ｌ期　药物研究　促黄体生成激素释放激素拮抗类似物的分离纯化研究　刘苗苗　（天津市计划生育研究所药物室，天津　３００１９１）　摘要：目的采用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）法分离纯化促黄体生成激素释放激素（ＬＨＲＨ）枯抗类似物。方法制备型色谱柱为Ｄｙｎａｍａｘ一３００Ａ　型ｃｌ　８柱（２５Ｏ　ｍｍ×４．１４　ｍｍ，５　ｍ），分析型色谱柱为Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ型Ｃ，８柱（２５０　ｍｍ×５　ｍｍ，５　ｍ）；流动相Ａ为含０．１％三氟醋酸和３％乙腈　的水溶液（ｐＨ：２），流动相Ｂ为含７Ｏ％乙腈的水溶液；流速为４０　ｍＬ／ｍｉｎ（用于分离）和１．２　ｍＬ／ｍｉｎ（用于分析）；检测波长为２２０　ｎｍ。结果　ＬＨＲＨ拮抗类似物纯品的产率可达２２％～５２％，纯度高达９７％～９９％，分离度大于１．５。结论ＨＰＬＣ法分离纯化的ＬＨＲＨ拮抗类似物纯　品产率大，纯度高，且该法操作简便、快捷。　关键词：高效液相色谱法；分离纯化；促黄体生成激素释放激素拮抗类似物　中图分类号：Ｒ９１４：Ｒ９７８．１　６　文献标识码：Ａ　文章编号：ｌＯ０６—４９３ｌ（２０Ｏ９）Ｏｌ二００Ｏ７—０２　Ｓｔｕｄｙ　０ｎ　ＳｅｐａｒａｔｉＯｎ　ａｎｄ　ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉＯｎ　Ｏｆ　ＬＨＲＨ　Ａｎｔａｇ０ｎｉｓｔｓ　ｂｙ　ＨＰＬＣ　“　Ⅱｏ，ｎ　ｒ上ｏ　ｆ　。　几肘“ｎ　。ｆ　ｅ８ｒｃ＾　胁“把＿厂０ｒ　Ｆ０ｍ　Ｐ２０肌　，　Ⅱ　ｎ，　。　３０Ｄ　９』Ｊ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ｏｂ　ｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｑｕｉＩｌｅ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｕｎｅｉｎｉｚｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　（ＬＨＲＨ）　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ　ｂｙ　ＨＰＬＣ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＨＰＬＣ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ．Ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ｔｙｐｅ　ｃｏｌｕｍｎ　（Ｄｙｎａｍａｘ一３００Ａ　Ｃ】８，２５０　ｍｍ×４．１４　ｍｍ，５　ｍ）　ａｎｄ　ａｎａｌｙｔｉｃａ１　ｔｙｐｅ　ｃｏｌｕｍｎ　（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　Ｃｌ８，２５０　ｍｍ×５　ｍｍ，５　ｍ）；ｔｈｅ　ａｑｕｅ０ｕｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　１％　ｔｒｉｎｕｏＩ＿ｔ】ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　３％　ａｃｅｔ０ｎｉｌｅ　ａｓ　ｔｈｅ　ｍ０ｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　Ａ（ｐＨ＝２），　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　７０％　ａｃｅｔｏｎｉ１ｅ　ａｓ　ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　Ｂ；ｔｈｅ　ｎｏｗ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　４Ｏ．０　ｍＬ／ｍｉｎ　（ｆｎｒ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）　ａｎｄ　１．２　ｍＬ／ｍｉｎ　（ｆ０ｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ），ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃ【ｉｎｇ　ｗａｖｅ１ｅｎｇｔｈ　ｗａｓ　２２０　ｎｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｐｒ０ｄｕｃｔ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｗａｓ　２２％一５２％　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ｗａｓ　９７％一　９９％，ｔｈｅ　ｒｅｓｏ１ｕｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｌａｒｇｅ　ｔｈａｎ　１．５．Ｃ０ｎｃｌｕｓｉ０ｎ　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｆａｓｔ．Ｔｈｅｒｅｆｂｒｅ　ＬＨＲＨ　ａｎｔａｇ０ｎｉｓｔｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｗｅｌｌ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｗａｙ　０ｆ　ＨＰＬＣ．　Ｋｅ１ｒ、ｖ０ｒｄｓ：ＨＰＬＣ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ—ｐｕ　ｒｊｆｉｃａｔｉ０ｎ；ＬＨＲＨ　ａｎｔａｇ０ｎｉｓｔｓ　自１９７１年阐明促黄体生成激素释放激素（ＬＨＲＨ）的结构（Ｐ—　Ｇｌｕ—Ｈｉｓ—Ｔ　ｐ—ｓｅｒ—Ｔｙｒ—Ｇｌｙ—Ｌｅｕ—Ａｒｇ—Ｐｍ—Ｇｌｙ—ＮＨ２）以来，　相继又合成了数以千计不同氨基酸取代的ＬＨＲＨ类似物，特别是　非天然氨基酸取代的拮抗类似物的研究为抗生育及治疗内分泌紊　乱引起的各种疾病带来了希望。Ｍｅｒｒ浓ｅｌｄ固相化学合成法方法复　杂而费用昂贵，且仅得到ＬＨＲＨ拮抗类似物粗品，需要进行色谱分　离才能得到可供生物试验的ＬＨＲＨ拮抗类似物纯品。因此，ＬＨＲＨ　拮抗类似物合成筛选中的分离纯化工作显得十分重要，国内相关　研究报道甚少　。笔者通过研究１０个ＬＨＲＨ拮抗类似物的理化　性质和构效关系，初步建立了高效液相色谱（ＨＰＬｃ）分离纯化的方　法　】，现报道如下。　１　仪器与试药　冷冻干燥机。ＬＨＲＨ拮抗类似物粗品（德国ＡｓＴＡ医药公司化学合　成实验室）；乙腈为色谱纯（美国Ｍｅｒｃｋ公司）；醋酸和三氟醋酸为　分析纯（瑞士Ｆｌｕｋａ公司）；水为超纯水。　２方法与结果　２　１　色谱条件　色谱柱：制备型色谱柱为Ｄｖｎａｍａｘ一３ｏ０Ａ　ｃ１　８柱（２５０　ｍｍ×　４．１４　ｍｍ，５　ｍ），分析型色谱柱为Ｎｕｃｌｅ０ｓｉｌ　ｃｌ８柱（２５Ｏ　ｍｍ×５　ｍｍ，　５　ｍ）；流动相：流动相Ａ为含０．１％三氟醋酸和３％乙腈的水溶液　（ｐＨ＝２），流动相Ｂ为含７０％乙腈的水溶液；流速：４０　ｍＬ／ｍｉｎ（用　于分离），１．２ｍＬ／ｍｉｎ（用于分析）；检测波长：２２０　ｎｍ。　２．２　样品处理　称取ＬＨＲＨ拈抗类似物粗品１５Ｏ～３５０　ｍｇ，置５０　ｍＬ小烧杯　内，加５０％的醋酸５　ｍＬ和流动相Ａ＋Ｂ液（１：１）５　ｍＬ溶解，并超　高效液相制备型及分析型仪器（日本岛津公司），包括ｓｈｉ—　ｍａｓｚｕ　ＳＣＬ一８Ａ梯度控制器，Ｓｈｉｍａｓｚｕ　ｓＰＤ一６Ａ紫外检测器，ｓｈｉ—　ｍａｓｚｕ　Ｃ—Ｒ４Ａ图谱数控处理器）；Ｂｒｕｋｅｒ　Ａｖａｎｃｅ型核磁共振波谱仪　（瑞士Ｓｐｅｃｔｒ（】ｓｐｉｎ公司）；３２０一ＭＳ型质谱仪（美国瓦里安公司）；　Ｂａｎｋｅｓｉｎ　ｓ０ｎ０ｒｅｘ　ＲＫ５ｌ０Ｓ超声波振荡器，ｓｅｒｓＩｐｕｒ　ＬＦＭ２０纯水器，　声振荡５　ｍｉｎ。然后用高效液相专用注射器一次性进样，通过显示　器和组分收集控制器对液体样品进行选择性收集，并将分离得到　的纯品组分旋转蒸发浓缩，冻干成型。最后对纯品进行ＨＰＬＣ纯度　分析及核磁（ＮＭＲ）、质谱（ＭＳ）结构鉴定。　化酶（Ｓ０Ｄ）、过氧化氢酶、过氧化物酶、谷胱甘肽一ｓ一转移酶　事水产品的研究，（电子信箱）ｊｊｚｈｕ３８＠１６３．ｃｏｍ。　参考文献：　［１】万德光，吴家荣．药用动物学［Ｍ】．上海：上海科学技术出版社，１９９３：　４５—４７．　（ＧｓＴ）的活性降低，谷胱甘肽的水平也降低，脂质过氧化物和胆红　素水平提高。河蚬提取物可明显防止这些酶活性的降低和谷胱甘　肽水平的降低，这可能与其具有稳定细胞膜的功能有关，可使损伤　的细胞膜得以恢复，通透性降低，从而使ＡＩ｜Ｔ的释放速度减慢，血　清中Ａ　的水平降低。ｃｃｌ　诱导肝损伤主要是通过释放自由基攻　击肝细胞膜，导致细胞膜通透性增加而释放ＡＬＴ，使ＡＬＴ水平升　［２］Ｋ０ｎｇ　ＺＬ，Ｃｈｉａ“ｇ　ＬＣ．Ｆａｎｇ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｉｍｍｕｎｅ　ｂｉ０ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｓｈｅＩＪ６ｓｈ　ｔ０ｗａｒｄ　ｓｅｍｍ—ｆｒｅｅ　ｃｕＩｔｕｒｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｃｅＩｌ　ｌｉｎｅｓ【Ｊ】．Ｂｉ０ｓｃｉ　Ｂｉ０ｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉ０ｃｈｅｍ，　ｌ９９７．６ｌ：２４—２８．　［３］Ｓａｋｓｅｎａ　Ｓ，Ｒａｓｔｏｇｉ　Ｒ，Ｇａｒｇ　ＮＫ，ｅｔ　ａ１．Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ　ｎｄｕｃｅｄ　ｈｅｐａｔｏｔ０ｘｉｃｉ　ｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ：ｐｒ０ｔｉｖｅ　ｅｆ　ｃｔ　ｏｆ　ｐｉｃｒｏｌｉｖ【Ｊ】．Ｄｍｇ　Ｄｅｖｅｌｏｐｎｌｅｎｔ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｌ９９４：　３３：４６—５Ｏ．　高。河蚬提取物对这种肝损伤有明显的改善作用，其机理可能与其　具有清除自由基作用有关。　作者简介：景金柱（１９７８一），男，在职研究生，工程师，主要从　（收稿日期：２ＯＯ８—０８—１２）　・中国茗专业（　口ｊ　口ｒＪ　口ｃ　Ｈｆ　Ⅱ　７・　药物研究　荆芥穗化学成分研究　伍彬　４０００３Ｏ）　（重庆医药高等专科学校，重庆２００９年第ｌ８卷第ｌ期　摘要：目的研究荆芥穗的化学成分。方法利用色谱技术进行分离纯化，波谱技术进行结构鉴定。结果从剂芥穗中分离得到８个化舍物。　分别鉴定为反式桂皮酸（１）、ｐ一谷甾醇（２）、３一羟基一４（８）一烯一Ｐ一薄荷烷～３（９）一内酯（３）、芹菜素（４）、ｓｃｈｉｚ０ｎｅｐｅｔ０ｓｉｄｅｓ　Ｂ（５）、木犀草　素（６）、ｔｉｌｉａｎｉｎ（７）和橙皮苷（８）。结论该植物有较好的研究价值。　关键词：荆芥穗；黄酮；化学成分　中图分类号：Ｒ２８４．１；Ｒ２８２．７ｌ　文献标识码：Ａ　文章编号：１００６—４９３１（２０Ｏ９）Ｏ１—００Ｏ８—０２　Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｓｃ　Ｄ，ｌｅ　ｆ日　Ｗ　Ｂ　ｚｌ　砌Ｂｒｉｑ．　ｌ　Ｃｈｏｎｇｑｔｎｇ　Ｉｍｔｎｍｅ　ｏｊ　Ｈｅｎｔｔｈ　ｓｃｔｅ　ｅｓ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，Ｃｈｉｎｎ　４ｏｏｏ３ｏ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ｏｂｊｅｃｔｉＶｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃ０ｍｐｏｓｉｔｉ０ｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｐｉｋｅｓ　ｏｆ　ｓｃｈｉｚｏｎｅｐｅｔａ　ｔｅｎｕｉｆ０ｌｉａ　Ｂｒｉｑ．Ｍｅｔｈ０ｄｓ　Ｔｈｅ　ｃｈｍｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔ０　ｉｓｏｌａｔｅ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｙ　ｔｈｅ　ｃ０Ｉｎｐｏｓｉｔｉ０ｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ　ｍｅｔｈ０ｄｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　８ｔｍｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｐｉｋｅｓ　ｏｆ　Ｓｃｈｉｚｏｎｅｐｅｔａ　ｔｅｎｕｉｆ０ｌｉａ　Ｂ　ｑ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｅｉｇｈｔ　ｃｏｍｐ０ｕ【ｌｄｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｄ　ｅｄ　ａｓ　ｆ０１１ｏｗｓ：ｔｒａｎｓｃｉｎｎａｍｉｃ　ａｃｉｄ（１），Ｓ—ｓｉｔ０ｓｔｅｒｏｌ（２），３一ｈｙｄｍｘｙ一　４（８）一ｅｎｅ—ｐ—ｍｅｎｔｈａｎｅ一３（９）一ｌａｃｔｏｎｅ（３），ａｐｉｇｅｎｉｎ（４），ｓｃｈｉｚｏｎｅｐｅｔ０ｓｉｄ　ｅｓ　Ｂ（５），ｌｕｔｅ０ｌｉｎ（６），ｔｉｌｉａｎｉｎ（７）　ａｎｄ　ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ（８）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ｆＩ】ｌｌｙ　ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ．　Ｋｅｙ　ｗＯｒｄｓ：ｓｐｊｋｅｓ　Ｓｃｈｊｚｏｎｅｐｅｔａ　ｔｅｎｕｊｆ０Ｊｊａ　Ｂ　ｑ；ｎａｖｏｎ０ｊｄｓ；ｃｈｅｍｊｃａＪ　ｃｏｍｐｏｓｊｔｊｏＪ】ｓ　荆芥穗为唇形科植物荆芥ｓｃ　拓０，　ｅ　把ｎＭ　加　Ｂｒｉｑ．的干燥　花穗，性微温，味辛，入肝肺经，用于治疗感冒、头痛、麻疹、疮疡初　起等症状…。笔者对荆芥穗的化学成分进行了研究，从中分离鉴定　了８个化合物，其中木犀草素、橙皮苷、Ｂ一谷甾醇、桂皮酸具有抗　炎抑菌抗病毒活性　“　；芹菜素具有解痉、抗胃溃疡作用　，它们的　活性与荆芥穗的功效相关联。　２　提取分离　将５　荆芥穗用稀醇５０　Ｌ回流提取３次，每次１　ｈ，回收溶剂　后得浸膏。浸膏用８倍水分散，以ＡＢ一８型大孔吸附树脂吸附，　水、稀醇洗脱，得稀醇洗脱部分２９５　ｇ。　取稀醇洗脱部分２９５　ｇ，经硅胶柱层析，氯仿一甲醇梯度洗脱　分为３部分。取第ｌ部分ｌ１０　ｇ，再经硅胶柱层析，氯仿一甲醇梯度　洗脱，得到５Ｏ个流分。流分２～５（５．４　ｇ）经硅胶柱层析，石油醚一　ｌ　仪器和试药　ｘ一４型显微熔点仪（温度计未校正）；ＪＥ一０Ｌ一３００型和　Ｂｎｌｋｅｒ—Ａｖａｎｃｅ　ＤＲｘ一５００型核磁共振仪：ＥｓＯｕ　ＩＲＥ—Ｌｃ型和　丙酮梯度洗脱，丙酮重结晶，得到化合物１（１２　ｍｇ）、２（１５ｍｇ）和３　（５５　ｍｇ）；流分ｌ２—２５（５．８　ｇ）反复经硅胶柱层析，氯仿一甲醇、石油　醚一丙酮梯度洗脱，得到化合物４（２２　ｍｇ）、５（１２　ｍｇ）和６（３２　ｍｇ）；　流分２６～４５（８．５　ｇ）经聚酰胺柱层析，水一乙醇、氯仿一甲醇系统　梯度洗脱，得到化合物７（１８　ｍｇ）和８（１２０　ｍｇ）。　３　结构鉴定　ｖＧ一２０—２５０型质谱仪；薄层色谱和柱色谱硅胶（青岛海洋化工　厂）；ｓｅｐｈａｄｅｘＬＨ一２０（上海化学试剂采购供应站分装厂）；ＡＢ一８　型大孔吸附树脂（天津南开大学化工厂）；柱色谱聚酰胺（上海化学　试剂公司）。荆芥穗购于重庆储奇门药材市场，经重庆医药高等专　科学校天然药物教研室代宇副教授鉴定为荆芥５ｃ＾　ｏ，　ｅ　。　把ｎＭ　ｒｏ　（Ｂｅｎｔｈ．）Ｂｒｉｑ的干燥花穗。　化合物１：无色针晶（甲醇），熔点（ｍｐ）为ｌ３２～１３４℃。ＥＩ—Ｍｓ　ｍ／　（％）为１４８【Ｍ】－（８６），１４７［Ｍ一１】．（１００），１３５（８２），１０３（５６），　２．３　结果　试验分离纯化的ＬＨＲＨ拮抗类似物由于结构略有不同，对柱填料的　吸附能力和被溶剂洗脱的难易程度也有一定差异。因此，在分离过　程中优化了梯度程序并调整流动相配比，使溶剂峰和杂质峰与样品　峰的分离度达到满意，通过公式计算，分离度大于１．５。结果表明，　ＬＨＲＨ拮抗类似物纯品的产率最高可达５２．８２％，且纯度均在９７％　以上。试验中发现加入５０％的醋酸对ＬＨＲＨ拮抗类似物的分解及　结果见表１。　表１　ＬＨＲＨ拮抗类似物分离纯化的条件和结果　峰形起着重要作用，如果加入的醋酸量不足，则峰形圆钝、保留时间　延迟，最终造成分离效果差、纯度低、产率不理想。温度过高对色谱　分离柱的分离效果也有一定影响，故认为最佳温度为（２５±１）℃。　参考文献：　［１】郄冰冰，郭瑞锋，何建峰．反相高效液相色谱法检查中药保健品中８种　激素类成分［Ｊ］．中国药业，２００７，ｌ６（１７）：ｌ９．　【２］师治贤，王俊德．生物大分子的液相色谱分离和制备【Ｍ］．第２版．北　京：科学出版社，１９９９：２３—５７．　３　讨论　［３］国家药典委员会．中华人民共和国药典（二部）［Ｍ］．北京：化学工业出　版社，２Ｏ００５：附录ＶＤ．　１—１Ｏ号ＬＨＲＨ拮抗类似物均为含有ｌ０个氨基酸的多肽，其　结构不同之处在于所含非天然氨基酸不一样。从表１不难看出，本　・（收稿日期：２０Ｏ８—０３—０５；修回日期：２００８一Ｏ７—３Ｏ）　８・　中国荃　业Ｃ　ｆ，ｌ口ｊ　口ｒＪ竹口ｃＰ　ｆ　口