(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 108295194 A(43)申请公布日 2018.07.20
(21)申请号 201810224861.6(22)申请日 2018.03.19
(71)申请人 齐齐哈尔医学院
地址 161000 黑龙江省齐齐哈尔市建华区卜
奎北大街333号(72)发明人 费洪新 吴树亮 张晓杰 张英博 (74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理
有限责任公司 11139
代理人 孙皓晨 马鑫(51)Int.Cl.
A61K 36/84(2006.01)A61P 25/28(2006.01)
权利要求书1页 说明书17页 附图8页
(54)发明名称
一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物及其制备方法和应用(57)摘要
本发明公开了一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物及其制备方法和应用。本发明选择祖国医药黑芝麻、楮实、枸骨叶、铁皮石斛、蓝布正、盘龙参、化州橘红、薤白、佛手、苏合香、鬼箭羽、芸薹子、黄花倒水莲、栝楼、鹿衔草组成中药组合物，并开展了对阿尔茨海默病小鼠模型的治疗，结果表明本发明的中药组合物对阿尔茨海默病的综合治疗效果明显并且无副作用。本发明的提出为阿尔茨海默病的治疗提供了一种新的技术手段，可以产生巨大的经济效益和社会效益，应用前景非常广阔。CN 108295194 ACN 108295194 A
权 利 要 求 书
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1.一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的各原料组成：黑芝麻10-15重量份、楮实10-15重量份、枸骨叶15-25重量份、铁皮石斛20-30重量份、蓝布正15-25重量份、盘龙参10-15重量份、化州橘红3-5重量份、薤白5-10重量份、佛手4-8重量份、苏合香0.5-1重量份、鬼箭羽5-15重量份、芸薹子5-10重量份、黄花倒水莲20-25重量份、栝楼10-15重量份以及鹿衔草20-25重量份。
2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的各原料组成：黑芝麻12重量份、楮实12.5重量份、枸骨叶20重量份、铁皮石斛25重量份、蓝布正19.5重量份、盘龙参12重量份、化州橘红4.5重量份、薤白7.5重量份、佛手6重量份、苏合香0.65重量份、鬼箭羽10重量份、芸薹子8.25重量份、黄花倒水莲22.5重量份、栝楼12重量份以及鹿衔草22.5重量份。
3.权利要求1或2所述的中药组合物在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，向权利要求1或2所述的中药组合物中加入制剂成型所需的辅料，按照药物制剂常规方法做成临床上适宜的各种药物制剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物制剂为水煎剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂或口服液。
6.一种制备用于治疗阿尔茨海默病的水煎剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)按照权利要求1或2所述的重量份称取各原料；(2)将步骤(1)称取得到的各原料混合后，加入原料总重量10-20倍的蒸馏水，浸泡1.5-2.5h，之后煎煮1.5-2.5h，过滤，得到第一次中药组合物滤液以及残渣；
(3)向步骤(2)获得的中药组合物残渣中加入与步骤(1)相同体积的蒸馏水，浸泡中药组合物残渣1.5-2.5h，煎煮中药组合物残渣1.5-2.5h，过滤后，得到第二次中药组合物滤液；
(4)将第一次中药组合物滤液和第二次中药组合物滤液合并，混匀，即得到用于治疗阿尔茨海默病的水煎剂。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的过滤是指依次采用5层白色纱布、15层白色纱布分别过滤。
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一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物及其制备方法和
应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种中药组合物及其制备方法和应用，特别涉及一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物及其制备方法和应用。本发明属于中药技术领域。背景技术
[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)是临床上常见的老年性疾病，其发病率、患病率及死亡率逐年增加。近年来，阿尔茨海默病患者对家庭、社会和国家都带来了极大的精神负担和经济负担，其已经成为国外很多国家继心脑血管疾病、肿瘤、脑中风之后死亡率排在第四位的重要疾病，因此，积极有效治疗阿尔茨海默病就显得尤为重要。[0003]已经证实，阿尔茨海默病往往会出现脑内β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)大量沉积并在神经元外侧形成老年斑(Senile plaques，SP)，还会出现小胶质细胞(Microglia)、星形胶质细胞(Astrocytes)大量活化而诱发神经性炎症反应，更会出现在神经元内部神经原纤维不规则排列形成神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles，NFTs)，最终会引起脑海马神经毒性反应、炎症反应、氧化应激反应等，由此，很多研究者提出阿尔茨海默病的Aβ蛋白学说、炎症介质学说、神经血管假说、自由基损伤学说等。一般而言，Aβ蛋白学说、炎症介质学说、神经血管假说是阿尔茨海默病发病机制的重要学说，且彼此之间密切相关。脑内Aβ是由β-分泌酶与γ-分泌酶加工、水解β-淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid-βprecursor protein，APP)所产生，Aβ包括AββAβ可以形成可溶性、1-40和A1-42，1-42参与构成SP核心成分，扩散性Aβ寡聚体，进而促进阿尔茨海默病的发生及发展，最终损害脑海马神经元，导致学习记忆水平下降、海马结构异常(例如神经元和毛细血管结构异常)、激活脑小胶质细胞及星形胶质细胞分泌功能[例如白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)等产生增加]，还可以引起脑内产生大量自由基且常伴有抗氧化水平低下(例如总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶含量降低，丙二醛含量增加)。依据神经血管假说，脑内Aβ的清除和转运依赖血脑屏障(Blood brain barrier，BBB)的完整性。一旦BBB的完整性遭到破坏，会引起BBB通透性增加，导致Aβ的清除减少进而加重阿尔茨海默病的病情。资料显示，BBB的核心结构是血管内皮细胞，而血管内皮细胞上存在可以转运Aβ的蛋白复合体，晚期糖基化终末产物受体(Receptor for advanced glycation end-products，RAGE)与配体Aβ结合，会促进NF-κB通路活化，引起下游信号载脂蛋白J(Apolipoprotein J，Apo J)、载脂蛋白E(Apolipoprotein E，Apo E)、血管内皮细胞粘附因子-1(Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)表达异常，还会引起肿瘤坏死因子-α(Treating tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-1β等炎症介质含量增加，更会引起脑线粒体细胞凋亡途径相关的Bcl-2和Bax表达异常，最终将会促进阿尔茨海默病的发生及发展。[0004]目前，国内外诸多药物均可以治疗阿尔茨海默病，如乙酰胆碱酯酶(Acetylcholin esterase，AChE)抑制剂、抗氧化剂、抗神经元细胞凋亡药物、雌激素、神经营养因子、抗精神
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病药物、抗Aβ药物等，但是很多药物具有一定程度的不良反应，会给阿尔茨海默病患者健康带来危害，为此，积极探寻不良反应小且非常有效的治疗阿尔茨海默病药物就显得非常重要。
[0005]资料显示，中药具有协同效应强、不良反应小、靶点多和整体调节的特点，在延缓阿尔茨海默病进程、减弱炎症反应、保护神经元等方面具有独特优势，这为临床上治疗阿尔茨海默病带来了希望。由此，寻找极为有效的中药组合物开展阿尔茨海默病的治疗工作就显得尤为重要。
发明内容
[0006]本发明的目的在于提供一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物及其制备方法。[0007]为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：[0008]本发明的一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物，所述的中药组合物由以下重量份的各原料组成：黑芝麻10-15重量份、楮实10-15重量份、枸骨叶15-25重量份、铁皮石斛20-30重量份、蓝布正15-25重量份、盘龙参10-15重量份、化州橘红3-5重量份、薤白5-10重量份、佛手4-8重量份、苏合香0.5-1重量份、鬼箭羽5-15重量份、芸薹子5-10重量份、黄花倒水莲20-25重量份、栝楼10-15重量份以及鹿衔草20-25重量份。[0009]其中，优选的，所述的中药组合物由以下重量份的各原料组成：黑芝麻12重量份、楮实12.5重量份、枸骨叶20重量份、铁皮石斛25重量份、蓝布正19.5重量份、盘龙参12重量份、化州橘红4.5重量份、薤白7.5重量份、佛手6重量份、苏合香0.65重量份、鬼箭羽10重量份、芸薹子8.25重量份、黄花倒水莲22.5重量份、栝楼12重量份以及鹿衔草22.5重量份。[0010]中药黑芝麻，性平，味甘，归肝经、肾经、大肠经，其具有补肝益精、补肾益血、润肠通便的功效；楮实，性寒，味甘，归肝经、肾经，其具有补肝消肿、滋肾明目的功效；枸骨叶，性凉，味苦，归足厥阴肝经、足少阴肾经，其具有补肝养血、益肾养气、祛风除湿的功效；铁皮石斛，性微寒，味甘，归肺经、肾经，其具有滋阴清热、润肺益肾、明目强腰的功效；蓝布正，性凉，味甘、微苦，归肝经、脾经、肺经，其具有滋阴益气、健脾补血、润肺化痰的功效。盘龙参，性温，味甘、苦，归肝经、肺经、心经、肾经，其具有滋阴益气、清热解毒、补气壮阳的功效；化州橘红，性平，味苦、微辛，归肺经、脾经，其具有理气燥湿、散寒消痰的功效；薤白，性温，味辛、苦，归心经、肺经、胃经、大肠经，其具有理气散结、温中通阳的功效；佛手，性温，味辛、苦、甘，归肝经、脾经、胃经，其具有理气化痰、健脾舒肝、和胃止痛的功效；苏合香，性温，味辛、甘，归肺经、肝经、脾经、胃经，其具有开郁化痰、行气止痛、辟秽醒神的功效；鬼箭羽，性寒，味苦，归足厥阴肝经，其具有活血化瘀、消肿通经、杀虫解毒的功效；芸薹子，性温，味辛，归肝经、肾经，其具有活血化瘀、消肿散结、润肠通便的功效；黄花倒水莲，性平，味甘、微苦，归肝经、肾经、脾经，其具有活血调经、化瘀补气、健脾利湿的功效；栝楼，性寒，味甘、微苦，归肺经、胃经、大肠经，其具有消痰散结、清热宽胸、润燥滑肠的功效；鹿衔草，性温，味甘、苦，归肺经、胃经、肝经、肾经，其具有除湿祛风、补虚益肾、活血调经、强骨止血的功效。[0011]中医理论认为，肝主疏泄，其疏泄功能与神志活动密切相关。若肝疏泄功能正常，气机调畅、五脏调和，则人神志活动正常。当人到老年时，肝气始衰，七情失调，会引起肝气郁滞、气郁痰凝、气滞湿阻、气滞血瘀、郁久化火，导致上扰清空、神机失用，出现诸多痰、湿、火、瘀等病理产物，壅于五脏，损及心神，蒙蔽心包，神明无所主，最终脑失所养，而诱发阿尔
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茨海默病。可见，治疗阿尔茨海默病需要坚持从肝论治的基本原则，故而选择中药黑芝麻、楮实、枸骨叶进行补肝。一般而言，阿尔茨海默病多因为年高肝肾精血亏虚，髓海失充，神明无主，会引起头晕耳鸣、神情呆滞、健忘、语言蹇涩、步履不稳、食欲缺失，因此，针对阿尔茨海默病患者需要坚持滋阴填精，故而选择中药铁皮石斛、蓝布正、盘龙参进行滋阴。同时，因于肝失疏泄或肝不藏血，日久气病及血而成瘀血，瘀血阻窍，髓海浑浊，脑神失养，伴有气郁痰凝、气滞湿阻、神机受损而发病，故而选择中药化州橘红、薤白、佛手、苏合香进行理气开郁，选择中药鬼箭羽、芸薹子、黄花倒水莲进行活血化瘀，选择中药栝楼、鹿衔草进行消痰除湿。
[0012]基于以上综合分析，本发明选择15种中药：黑芝麻、楮实、枸骨叶、铁皮石斛、蓝布正、盘龙参、化州橘红、薤白、佛手、苏合香、鬼箭羽、芸薹子、黄花倒水莲、栝楼以及鹿衔草组成中药组合物。进一步的，本发明通过实验全面观察了中药组合物对阿尔茨海默病小鼠的影响及相关分子作用机制，包括考察阿尔茨海默病模型小鼠行为学、炎症介质、APP相关蛋白、抗氧化能力、血脑屏障通透性、海马超微结构、凋亡相关蛋白表达、脾指数、脑指数、胸腺指数，还要考察阿尔茨海默病模型小鼠海马RAGE、NF-κBp65、VCAM-1及ICAM-1等蛋白和基因表达以及其对阿尔茨海默病模型小鼠心、肺、肾、肝和体重的影响，结果表明，本发明的中药组合物高、中剂量(50.68g/kg、25.34g/kg)可明显改善阿尔茨海默病模型小鼠行为学、炎症介质、APP相关蛋白、抗氧化能力，还可明显改善阿尔茨海默病模型小鼠脑血脑屏障通透性、海马超微结构、凋亡相关蛋白表达、脾指数、脑指数和胸腺指数，更可明显改善阿尔茨海默病模型小鼠海马RAGE、NF-κBp65、VCAM-1及ICAM-1等蛋白和基因表达，同时，其对阿尔茨海默病模型小鼠心、肺、肾、肝和体重无影响，说明本发明的中药组合物对治疗阿尔茨海默病有效，并且无副作用。[0013]因此，在上述研究的基础上，本发明还提出了所述的中药组合物在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。[0014]其中，优选的，向所述的中药组合物中加入制剂成型所需的辅料，按照药物制剂常规方法做成临床上适宜的各种药物制剂。[0015]其中，优选的，所述的药物制剂为水煎剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂或口服液。[0016]在本发明的一个具体实施例中提供了一种制备用于治疗阿尔茨海默病的水煎剂的方法，包括以下步骤：[0017](1)按照权利要求1或2所述的重量份称取各原料；[0018](2)将步骤(1)称取得到的各原料混合后，加入原料总重量10-20倍的蒸馏水，浸泡1.5-2.5h，之后煎煮1.5-2.5h，过滤，得到第一次中药组合物滤液以及残渣；[0019](3)向步骤(2)获得的中药组合物残渣中加入与步骤(1)相同体积的蒸馏水，浸泡中药组合物残渣1.5-2.5h，煎煮中药组合物残渣1.5-2.5h，过滤后，得到第二次中药组合物滤液；[0020](4)将第一次中药组合物滤液和第二次中药组合物滤液合并，混匀，即得到用于治疗阿尔茨海默病的水煎剂。[0021]其中，优选的，所述的过滤是指依次采用5层白色纱布、15层白色纱布分别过滤。[0022]综上，本发明选择祖国医药黑芝麻、楮实、枸骨叶、铁皮石斛、蓝布正、盘龙参、化州橘红、薤白、佛手、苏合香、鬼箭羽、芸薹子、黄花倒水莲、栝楼、鹿衔草组成的中药组合物，并
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开展了对阿尔茨海默病小鼠模型的治疗，结果表明本发明的中药组合物对阿尔茨海默病的综合治疗效果明显并且无副作用。本发明的提出为阿尔茨海默病的治疗提供了一种新的技术手段，可以产生巨大的经济效益和社会效益，应用前景非常广阔。附图说明
[0023]图1为中药组合物对阿尔茨海默病小鼠学习能力的影响；
*#**[0024]注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05；
[0025]图2为中药组合物对阿尔茨海默病小鼠记忆能力的影响；
*#**[0026]注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05；
[0027]图3为中药组合物对阿尔茨海默病小鼠学习记忆保持能力的影响；
*#**[0028]注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05；
[0029]图4为中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马炎症介质的影响；
*#**[0030]注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05；
[0031]图5为中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马APP相关蛋白的影响；
*#**[0032]注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05；
[0033]图6为中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马乙酰胆碱代谢酶的影响；
*#**[0034]注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05；
[0035]图7为中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马凋亡相关蛋白表达的影响；
*#**[0036]注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05；
[0037]图8为中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马抗氧化能力的影响；
*#**[0038]注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05；
[0039]图9为中药组合物对阿尔茨海默病小鼠脑BBB通透性的影响；
*#**[0040]注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05；
[0041]图10为小鼠海马CA1区神经元超微结构(透射电子显微镜，×2550)；[0042]图11为小鼠海马CA1区神经元细胞质超微结构(透射电子显微镜，×6500)；[0043]图12为小鼠海马CA1区神经元细胞质超微结构(透射电子显微镜，×16500)；[0044]图13为小鼠海马CA1区毛细血管超微结构(透射电镜，×2550)；[0045]图14为小鼠海马CA1区毛细血管内皮细胞质超微结构(透射电镜，×6500)；[0046]图15为小鼠海马CA1区毛细血管内皮细胞质超微结构(透射电镜，×16500)；[0047]图16为中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马RAGE、NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1表达的影响；
*#**[0048]注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05；
[0049]图17为中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马RAGE、NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1基因的影响；
*#**[0050]注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05；
[0051]图18为中药组合物对阿尔茨海默病小鼠脾指数、胸腺指数和脑指数的影响；
*#**[0052]注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05；
[0053]图19为中药组合物对阿尔茨海默病小鼠心、肝、肾和肺指数的影响；
*#[0054]注：相较于对照组：P＞0.05；相较于模型组：P＞0.05；
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图20为中药组合物对阿尔茨海默病小鼠体重的影响。
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注：相较于对照组：P＞0.05；相较于模型组：P＞0.05。
具体实施方式
[0057]下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将更为明显。但实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。[0058]实施例1中药组合物的制备
[0059]所述的中药组合物由以下重量的各原料组成：黑芝麻12g、楮实12.5g、枸骨叶20g、铁皮石斛25g、蓝布正19.5g、盘龙参12g、化州橘红4.5g、薤白7.5g、佛手6g、苏合香0.65g、鬼箭羽10g、芸薹子8.25g、黄花倒水莲22.5g、栝楼12g、鹿衔草22.5g。[0060]实施例2中药组合物的制备
[0061]所述的中药组合物由以下重量份的各原料组成：黑芝麻10g、楮实15g、枸骨叶16g、铁皮石斛25g、蓝布正15g、盘龙参15g、化州橘红5g、薤白6g、佛手5g、苏合香1g、鬼箭羽8g、芸薹子8g、黄花倒水莲20g、栝楼12g以及鹿衔草20g。[0062]实施例3中药组合物的制备
[0063]所述的中药组合物由以下重量份的各原料组成：黑芝麻15g、楮实10g、枸骨叶25g、铁皮石斛20g、蓝布正25g、盘龙参10g、化州橘红3g、薤白10g、佛手8g、苏合香0.5g、鬼箭羽5g、芸薹子5g、黄花倒水莲25g、栝楼10g以及鹿衔草25g。[00]实施例4用于治疗阿尔茨海默病的水煎剂的制备[0065](1)按照以下重量称取各原料：[0066]黑芝麻36g、楮实37.5g、枸骨叶60g、铁皮石斛75g、蓝布正58.5g、盘龙参36g、化州橘红13.5g、薤白22.5g、佛手18g、苏合香1.95g、鬼箭羽30g、芸薹子24.75g、黄花倒水莲67.5g、栝楼36g、鹿衔草67.5g。[0067](2)第一次煎煮
[0068]将步骤(1)称取得到的各原料混合后，放入20000mL实验用高颈圆底烧瓶中，加入蒸馏水8200mL，将584.7g中药组合物浸泡2h，之后煎煮中药组合物2h，经过5层白色纱布、15层白色纱布分别过滤，得到第一次中药组合物滤液和残渣；[0069](3)第二次煎煮
[0070]将获得的中药组合物残渣放到20000mL实验用高颈圆底烧瓶中，加入蒸馏水8200mL，浸泡中药组合物残渣2h，煎煮中药组合物残渣2h，经过5层白色纱布、15层白色纱布分别过滤后，得到第二次中药组合物滤液；[0071](4)将第一次中药组合物滤液和第二次中药组合物滤液合并，混匀，即得到用于治疗阿尔茨海默病的水煎剂。
[0072]实验例1本发明中药组合物治疗阿尔茨海默病的药效学试验[0073]1实验材料[0074]1.1实验动物
[0075]雄性7月龄APP/PS1双转基因小鼠(APPswe/PS1dE9双转基因小鼠，世界公认阿尔茨
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海默病小鼠动物模型)由哈尔滨医科大学基础医学院解剖教研室吴树亮教授购买；野生型C57BL/6小鼠由黑龙江中医药大学中医药研究院周忠光教授购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2012-0001。所有动物常温常湿饲养于黑龙江中医药大学实验动物中心，并由黑龙江中医药大学实验动物中心李宝龙副主任负责APP/PS1双转基因小鼠及野生型C57BL/6小鼠的常规给药、饲养。[0076]1.2实验试剂
[0077]本发明阳性对照药物多奈哌齐购买于中国重庆植恩药业有限公司；中药组合物黑芝麻12g、楮实12.5g、枸骨叶20g、铁皮石斛25g、蓝布正19.5g、盘龙参12g、化州橘红4.5g、薤白7.5g、佛手6g、苏合香0.65g、鬼箭羽10g、芸薹子8.25g、黄花倒水莲22.5g、栝楼12g、鹿衔草22.5g，每份中药组合物的原药材重量为194.90g，均由黑龙江中医药大学周忠光教授购买于黑龙江中医药大学第一附属医院，由黑龙江中医药大学第一附属医院内分泌科栗明副主任医师鉴定该中药组合物可配伍组合使用，最后由黑龙江中医药大学田明教授将中药组合物制备成水煎剂、干粉、-80℃冰箱保存备用；APP、AβAβIL-1β、TNF-α和IL-6等酶1-40、1-42、联免疫试剂盒购买于南京建成生物工程研究所；RAGE、NF-κBp65购买于Boster公司；总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛试剂盒等购买于南京建成生物工程研究所；β-actin、VCAM-1及ICAM-1购买于Santa Cruz Biotechnology公司；RNeasy Mini试剂盒购自QIAGEN；PrimeScript RT试剂盒购自中国大连TaKaRa Biotechnology；PrimeScript RT试剂盒购自中国大连TaKaRa Biotechnology，其他所需试剂均为国产分析纯。
[0078]1.3实验仪器
[0079]组织脱水机购自于德国Leica公司；TGL-16G台式离心机购自于上海安亭科学仪器厂；6100型RT-雷杜酶标仪购自于美国RT公司；组织展片机购自于德国Leica公司；Morris水迷宫购自于安徽淮北正华生物仪器设备有限公司；电热恒温鼓风干燥箱购自于天津市泰斯特仪器有限公司；SIMF124机购自于日本SANYO公司；HMIAS高清晰度彩色医学图文分析系统购自于武汉千屏影像技术有限公司；TECNAIG2型透射电子显微镜购自于FEI/Philips公司；PLZOZ-S电子天平购自于梅特勒-托利多仪器有限公司；HP型凝胶成像分析系统购买于美国ProteinSimple公司等。[0080]2方法
[0081]2.1中药组合物提取
[0082]中药组合物包括黑芝麻12g、楮实12.5g、枸骨叶20g、铁皮石斛25g、蓝布正19.5g、盘龙参12g、化州橘红4.5g、薤白7.5g、佛手6g、苏合香0.65g、鬼箭羽10g、芸薹子8.25g、黄花倒水莲22.5g、栝楼12g、鹿衔草22.5g，共15种原药材，每份中药组合物的原药材重量为194.90g。
[0083]实验需要配制3倍的中药组合物原药材(584.70g中药组合物)，将584.70g中药组合物放入20000mL实验用高颈圆底烧瓶中，加入蒸馏水8200mL，将584.7g中药组合物浸泡2h，之后煎煮中药组合物2h，经过5层白色纱布、15层白色纱布分别过滤，将会得到第一次中药组合物滤液和残渣。
[0084]实验需要将获得的中药组合物残渣放到20000mL实验用高颈圆底烧瓶中，加入蒸馏水8200mL，浸泡中药组合物残渣2h，煎煮中药组合物残渣2h，经过5层白色纱布、15层白色
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纱布分别过滤后，将会得到第二次中药组合物滤液。
[0085]实验需要合并第一次中药组合物滤液和第二次中药组合物滤液，混匀后，将所有滤液放于蒸发容器内，将蒸发容器放于实验室干燥箱内进行干燥6d(温度为70℃)，每天6次(每次间隔4h)查看干燥箱内的液体蒸发情况，最终将会得到中药组合物干膏172.65g，此中药组合物出膏率＝[中药组合物干膏(g)/中药组合物原药材(g)]×100％，按照公式经过计算得到(172.65g/584.70g)×100％＝29.53％，可见，中药组合物出膏率为29.53％。[0086]实验需要使用粉碎机将中药组合物干膏进行粉碎，304不锈钢筛网(60目)过滤1次，304不锈钢筛网(100目)过滤1次，最终得到中药组合物干粉169.81g，中药组合物出粉率＝[中药组合物干粉(g)/中药组合物原药材(g)]×100％，经过计算得到(169.81g/584.70g)×100％＝29.04％，可见，中药组合物出粉率为29.04％。[0087]实验配制中药组合物原药材重量为584.70g，最终得到中药组合物干粉169.81g，即粉碎机粉碎及筛网过滤损失2.84g，中药组合物损失率＝[中药组合物干膏(g)－中药组合物干粉(g)]/中药组合物干粉(g)×100％，经过计算得到[(172.65g-169.81g)/172.65g]×100％＝1.％，可见，中药组合物损失率为1.％。[0088]最终，3份中药组合物584.70g经过水煮后可以获得中药组合物干粉169.81g，即1g中药组合物干粉相当于中药组合物原药材3.44g。将中药组合物干粉169.81g进行分装，20g/袋，最后1袋9.81g，同时标记每袋中药组合物干粉重量，-80℃冰箱内保存备用。[00]2.2中药组合物剂量的设定[0090]中药组合物包括黑芝麻12g、楮实12.5g、枸骨叶20g、铁皮石斛25g、蓝布正19.5g、盘龙参12g、化州橘红4.5g、薤白7.5g、佛手6g、苏合香0.65g、鬼箭羽10g、芸薹子8.25g、黄花倒水莲22.5g、栝楼12g、鹿衔草22.5g，共15种原药材，每份中药组合物的原药材重量为194.90g/成人标准体重。194.90g/成人标准体重是经过黑龙江中医药大学附属第一医院内分泌科栗明副主任医师鉴定后的常规患者剂量。按照小鼠和人的体表面积比值(0.0026：1)进行计算，可以获得标准体重小鼠中药组合物剂量是[(194.90g×0.0026)/0.02kg]×50＝25.34g/kg，此即中药组合物中剂量为25.34g/kg。按照中药组合物高剂量是中药组合物中剂量的2倍，而中药组合物低剂量是中药组合物中剂量的1/2，因此，实验设定中药组合物高剂量为(25.34g/kg)×2＝50.68g/kg，中药组合物低剂量为(25.34g/kg)/2＝12.67g/kg。最终，本发明中药组合物高、中、低剂量将分别设定为50.68g/kg、25.34g/kg、12.67g/kg。[0091]2.3阳性药物剂量的设定
[0092]多奈哌齐是一种长效阿尔茨海默病治疗药物，其能够可逆性地抑制乙酰胆碱酯酶，增加受体部位乙酰胆碱含量，进而改善阿尔茨海默病患者的病情。多奈哌齐常规剂量为5～10mg，依据小鼠和人的体表面积比值为(0.0026：1)进行计算，将会获得多奈哌齐常规剂量最小值为(5×0.0026×50)mg/kg＝0.65mg/kg且最大值为(10×0.0026×50)mg/kg＝1.3mg/kg，换算成分子是单位g后，获得多奈哌齐常规剂量最小值为0.00065g/kg且最大值为0.0013g/kg，经过黑龙江中医药大学周忠光教授评定，本实验选择0.001g/kg多奈哌齐作为常规剂量开展治疗阿尔茨海默病模型小鼠的实验工作。[0093]2.4模型筛选及实验分组
[0094]实验选择雄性7月龄APP/PS1双转基因小鼠60只为筛选对象，剪取APP/PS1双转基因小鼠鼠尾0.6cm进行基因鉴定，设计引物β-actin(446bp)：上游引物：5’-GAG ACC TTC
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AAC ACC CCA GC-3’，下游引物：5’-CCA CAG GAT TCC ATA CCC AA-3’；APP(377bp)：上游引物：5’-GAC TGA CCA CTC GAC CAG GTT CTG-3’，下游引物：5’-CTT GTA AGT TGG ATT CTC ATA TCC G-3’；PS1(608bp)：上游引物：5’-AAT AGA GAA CGG CAG GAG CA-3’；下游引物：5’-GCC ATG AGG GCA CTA ATC AT-3’。设计PCR反应体系：2倍mix为12.5μL，Primer-1为1μL，Primer-2为1μL，DNA为2μL，ddH2O为8.5μL，总体积为25μL。最后使用电泳仪Biorad PowerPac Universal(美国伯乐公司)进行琼脂糖凝胶电泳，设定参数，100V恒定电压，电泳PCR反应产物，使用HP型凝胶成像分析系统(美国ProteinSimple公司)进行分析，鉴定出阳性APP/PS1双转基因小鼠。
[0095]本实验经过哈尔滨医科大学基础医学院解剖教研室吴树亮教授鉴定后，5只小鼠仅仅表达APP基因，10只小鼠仅仅表达PS1基因，还有5只小鼠未表达APP基因或PS1基因，最终确定以40只同时表达APP基因及PS1基因的阳性APP/PS1双转基因小鼠为实验对象。将阳性表达APP基因及PS1基因的APP/PS1双转基因小鼠随机分成模型组、多奈哌齐组、中药组合物高剂量组(简称高剂量组)、中药组合物中剂量组(简称中剂量组)、中药组合物低剂量组(简称低剂量组)，每组8只小鼠。另外，设定同月龄、同背景、健康C57BL/6小鼠8只为对照组。[0096]2.5实验给药
[0097]对照组C57BL/6小鼠给予等量生理盐水灌胃，模型组小鼠给予等量生理盐水灌胃，多奈哌齐组给予多奈哌齐0.001g/kg灌胃，中药组合物高剂量组给予相当于中药组合物原药材50.68g/kg灌胃，中药组合物中剂量组给予相当于中药组合物原药材25.34g/kg灌胃，中药组合物低剂量组给予相当于中药组合物原药材12.67g/kg灌胃。灌胃持续时间为40d。[0098]2.6检测行为学指标
[0099]行为学指标包括学习能力、记忆能力、学习记忆保持能力，可以使用定位航行能力实验(逃避潜伏期)检测小鼠学习能力，使用空间探索能力实验(游泳距离)用于检测小鼠记忆能力，跨越平台实验(跨平台次数、目标象限停留时间)用于检测小鼠学习记忆保持能力。常规采用Morris水迷宫仪器进行测定，Morris水迷宫包括蒸馏水液体池、可移动圆形台、可视化计算机、摄像投影机和综合分析系统。蒸馏水液体池平均分为四个象限，包括第I、II、III、IV象限，蒸馏水液体池的水温(23±2)℃，水深20cm，可移动圆形台放于第IV象限，保持室内外的参照物一致，无其他噪音、光线干扰，蒸馏水液体池内放上奶粉及白色素。Morris水迷宫设定时间是5d，其中第1～4d为小鼠训练时间，第5d为小鼠测试时间，每次小鼠训练时间为65s。小鼠放置初始位置分别为Morris水迷宫第I、II、III象限的边缘，且保持小鼠背对背进行放置Morris水迷宫内。若小鼠65s内未找到第IV象限可移动圆形台，则将小鼠引至第IV象限可移动圆形台停留10s，此时小鼠逃避潜伏期为60s。第5d开始测试小鼠学习能力，记录小鼠到达第IV象限可移动圆形台位置的逃避潜伏期、小鼠找到第IV象限可移动圆形台的游泳距离、跨越平台所在位置次数(跨平台次数)、移动平台所在象限的游泳时间(目标象限停留时间)，最终将有效评价小鼠的学习能力、记忆能力、学习记忆保持能力，以此来评价小鼠行为学指标。
[0100]2.7检测炎症介质、凋亡相关蛋白、Aβ相关蛋白及乙酰胆碱代谢酶[0101]炎症介质、凋亡相关蛋白、Aβ相关蛋白及乙酰胆碱代谢酶均可采用酶联免疫吸附法进行检测，其中，炎症介质包括IL-1β、TNF-α、IL-6，凋亡相关蛋白包括Bcl-2、Bax，Aβ相关蛋白包括海马APP、AβAββ乙酰胆碱代谢酶包括胆碱乙酰转移酶及乙酰1-42、1-40和血清A1-40，
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胆碱酯酶。各组小鼠行为学指标检测结束后，抓取小鼠，眼球取血，滴入离心管，静置1h，TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)3000rpm/min离心20min，血清转移到EP小管，用以检测血清Aβ同时，在冰上迅速取材各组小鼠脑海马进行清洗后，匀浆，静置，TGL-16G1-40，
台式离心机(上海安亭科学仪器厂)3000rpm/min离心20min，取上清液，分装，采用6100型RT-雷杜酶标仪(美国RT公司)进行检测450nm的波长下的吸光度值(OD)，根据标准曲线的方程进行计算OD值，最终将检测海马IL-1β、TNF-α、IL-6、Bcl-2、Bax、APP、AβAβ胆碱乙1-42、1-40、酰转移酶、乙酰胆碱酯酶及血清Aβ1-40等表达。[0102]2.8检测抗氧化能力
[0103]抗氧化能力使用总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛进行表示。各组小鼠行为学指标检测结束后，抓取小鼠，使用水合氯醛麻醉小鼠，在冰上取材脑进行清洗后，取材各组小鼠海马，匀浆，静置1h，TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)3000rpm/min离心20min，取上清液，进行分装，按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书检测各组小鼠脑海马总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛含量。
[0104]2.9检测脑BBB通透性
[0105]脑BBB通透性用脑伊文氏蓝(EB)的渗出量进行表示。需要以EB浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出脑EB标准曲线方程，根据EB标准曲线方程将会计算出EB的渗出量，进而评价脑BBB通透性。各组小鼠行为学指标检测结束后，抓取小鼠，尾静脉注射2％EB，水合氯醛麻醉，左心室灌注生理盐水约65mL，同时需要剪开小鼠右心耳，迅速解剖，取脑，记录小鼠脑重量为脑湿重，将小鼠脑浸泡于甲酰胺溶液，45℃避光孵育72h，匀浆，TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)3000rpm/min离心15min，使用6100型RT-雷杜酶标仪(美国RT公司)630nm处检测各组小鼠脑上清液吸光度值。根据脑EB标准曲线方程求出EB含量。EB含量用EB浓度(μg/mL)或EB浓度/脑湿重(μg/g)来表示。[0106]2.10检测海马超微结构
[0107]阿尔茨海默病海马超微结构需要重点观察海马CA1区的超微结构。各组小鼠行为学指标检测结束后，抓取小鼠，水合氯醛麻醉，固定、开胸，暴露心脏，左心室缓慢匀速点滴生理盐水约85mL，随后用2.5％戊二醛进行缓慢匀速灌注约70mL，直到小鼠四肢及尾巴僵硬为止。在超净工作台上，取材小鼠脑海马，将海马CA1区切成1～3mm3小块，预固定2h、四氧化锇固定、脱水、包埋、切片、染色，使用TECNAIG2型透射电子显微镜(FEI/Philips公司)观察小鼠脑海马CA1区超微结构。[0108]2.11检测海马蛋白表达
[0109]采用免疫组织化学常规方法检测小鼠脑海马RAGE、NF-κBp65、VCAM-1及ICAM-1蛋白表达。各组小鼠行为学指标检测结束后，抓取小鼠，10％水合氯醛麻醉小鼠，开胸、暴露心脏、剪开右心耳，左心室缓慢匀速点滴生理盐水约90mL，随后4％多聚甲醛匀速灌注生理盐水约50mL，直到小鼠四肢及尾巴僵硬为止，取材全脑，去除小脑和脑干，经过脑海马固定、脱水、透明、切片、烘烤等步骤，采用免疫组织化学常规方法检测小鼠脑海马RAGE、NF-κBp65、VCAM-1及ICAM-1蛋白表达(平均光密度值)并进行分析。[0110]2.12检测海马基因表达
[0111]采用Real-time-PCR检测各组小鼠海马RAGE、NF-κBp65、VCAM-1及ICAM-1基因的表
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达。各组小鼠行为学指标检测结束后，抓取小鼠，迅速处死，取材脑海马，提取总RNA，并反转录成cDNA，设计β-actin、RAGE、NF-κBp65、VCAM-1及ICAM-1引物，加入特殊SYBR Green I绿色荧光材料，设置海马RAGE、NF-κBp65、VCAM-1及ICAM-1基因的反应参数，通过Real-time-PCR进行实时监测SYBR Green I荧光信号强弱，采用2-ΔΔCt法计算RAGE、NF-κBp65、VCAM-1及ICAM-1基因相对表达量，最后进行统计分析RAGE、NF-κBp65、VCAM-1及ICAM-1基因的实验数据。
[0112]2.13检测体重和脏器指数
[0113]各组小鼠行为学指标检测结束后检测小鼠体重，统计小鼠在给药过程中体重数据变化，并进行统计分析。另外，实验结束后，抓取小鼠，断头处死小鼠，在超净工作台上解剖小鼠，取材小鼠脾、胸腺、脑、心、肺、肾、肝等脏器，洗涤脏器、吸干水分，称量脏器质量，按照脏器指数计算公式开始计算小鼠脏器指数。脏器指数(mg/g)＝脏器质量(mg)/小鼠体重(g)。
[0114]2.14统计分析
[0115]
实验采用SPSS19.0软件分析数据，数据采用表示，多组间比较采用单因素方差
分析数据，差异具有统计学意义使用P<0.05进行表示，差异不具有统计学意义使用P＞0.05
进行表示。[0116]3结果
[0117]3.1中药组合物对阿尔茨海默病小鼠学习能力的影响[0118]结果表明，随着各组小鼠训练时间延长，各组小鼠逃避潜伏期均呈现整体下降趋势。统计分析测试第5d逃避潜伏期可见，相较于对照组，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长(P＜0.05)；相较于模型组，多奈哌齐组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠逃避潜伏期明显缩短(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组小鼠逃避潜伏期改变不明显(P＞0.05)，以上说明中药组合物高、中剂量可以改善阿尔茨海默病小鼠学习能力。见表1、见图1。
[0119][0120]
表1中药组合物对阿尔茨海默病小鼠学习能力的影响(n＝8)
*#**
注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05
[0122]3.2中药组合物对阿尔茨海默病小鼠记忆能力的影响[0123]结果表明，随着各组小鼠训练时间延长，各组小鼠游泳距离均呈现整体下降趋势。统计分析第5d游泳距离可见，相较于对照组，模型组小鼠游泳距离明显增加(P＜0.05)；相
[0121]
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较于模型组，多奈哌齐组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠游泳距离明显减少(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组小鼠游泳距离改变不明显(P＞0.05)，以上说明中药组合物高、中剂量可以改善阿尔茨海默病小鼠记忆能力。见表2、见图2。
[0124][0125]
表2中药组合物对阿尔茨海默病小鼠记忆能力的影响(n＝8)
*#**
注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05
[0127]3.3中药组合物对阿尔茨海默病小鼠学习记忆保持能力的影响[0128]结果表明，相较于对照组，模型组小鼠跨平台次数明显降低(P＜0.05)，目标象限停留时间明显缩短(P＜0.05)；相较于模型组，多奈哌齐组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠跨平台次数明显增加(P＜0.05)，目标象限停留时间明显延长(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组小鼠目标象限停留时间和跨平台次数改变不明显(P＞0.05)，说明中药组合物高、中剂量可以改善阿尔茨海默病小鼠学习记忆保持能力。见表3、见图3。
[0126]
[0129][0130]
表3中药组合物对阿尔茨海默病小鼠学习记忆保持能力的影响(n＝8)
*#**
注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05
[0132]3.4中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马炎症介质的影响[0133]结果表明，相较于对照组，模型组小鼠海马炎症介质IL-1β、TNF-α、IL-6含量明显增加(P＜0.05)；相较于模型组，多奈哌齐组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠海马炎症介质IL-1β、TNF-α、IL-6含量明显降低(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组小鼠
[0131]
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海马炎症介质IL-1β、TNF-α、IL-6含量改变不明显(P＞0.05)，说明中药组合物高、中剂量可以改善阿尔茨海默病小鼠海马炎症介质水平。见表4、见图4。
[0134]表4中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马炎症介质的影响(n＝8)
[0135]
*#**
注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05
[0137]3.5中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马APP相关蛋白的影响[0138]结果表明，相较于对照组，模型组小鼠海马APP、海马Aβ海马Aβ血清Aβ1-40、1-42、1-40含量明显增加(P＜0.05)；相较于模型组，多奈哌齐组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠海马APP、海马Aβ海马Aβ血清Aβ而中药组1-40、1-42、1-40含量明显降低(P＜0.05)，合物低剂量组小鼠海马APP、海马Aβ海马Aβ血清Aβ1-40、1-42、1-40含量改变不明显(P＞0.05)，说明中药组合物高、中剂量可以改善阿尔茨海默病小鼠海马APP相关蛋白水平。见表5、见图5。
[0136]
[0139][0140]
表5中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马APP相关蛋白的影响(n＝8)
[0141]
[0142][0143][0144]
*#**
注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.053.6中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马乙酰胆碱代谢酶的影响结果表明，相较于对照组，模型组小鼠海马乙酰胆碱酯酶活性明显增高(P＜
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0.05)，胆碱乙酰转移酶含量明显降低(P＜0.05)；相较于模型组，多奈哌齐组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠海马乙酰胆碱酯酶活性明显降低(P＜0.05)，胆碱乙酰转移酶含量明显增高(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组小鼠海马乙酰胆碱酯酶、胆碱乙酰转移酶含量改变不明显(P＞0.05)，说明中药组合物高、中剂量可以改善阿尔茨海默病小鼠海马乙酰胆碱代谢酶活性。见表6、见图6。
[0145]表6中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马乙酰胆碱代谢酶的影响(n＝8)
[0146]
*#**
注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05
[0148]3.7中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马凋亡相关蛋白的影响[0149]结果表明，相较于对照组，模型组小鼠海马Bcl-2明显升高(P＜0.05)，海马Bax明显升高(P＜0.05)，但是Bcl-2/Bax比值明显降低(P＜0.05)；相较于模型组，多奈哌齐组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠海马Bcl-2明显升高(P＜0.05)，海马Bax改变不明显(P＞0.05)，但是Bcl-2/Bax比值明显升高(P＜0.05)，说明中药组合物高、中剂量可以改善阿尔茨海默病小鼠海马凋亡相关蛋白表达。见表7、见图7。
[0147]
[0150][0151]
表7中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马凋亡相关蛋白表达的影响(n＝8)
[0152][0153]
*#**
注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.053.8中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马抗氧化能力的影响
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结果表明，相较于对照组，模型组小鼠海马总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱
甘肽过氧化物酶含量明显降低(P＜0.05)，海马丙二醛含量明显升高(P＜0.05)；相较于模型组，多奈哌齐组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠海马总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶含量明显升高(P＜0.05)，海马丙二醛含量明显降低(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组小鼠海马总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛含量改变不明显(P＞0.05)，说明中药组合物高、中剂量可以改善阿尔茨海默病小鼠海马抗氧化能力。见表8、见图8。
[0155][0156]
表8中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马抗氧化能力的影响(n＝8)
[0157]
*#**
注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05
[0158]3.9中药组合物对阿尔茨海默病小鼠脑BBB通透性的影响[0159]结果表明，相较于对照组，模型组小鼠脑EB浓度和EB含量明显增加(P＜0.05)；相较于模型组，多奈哌齐组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑EB浓度和EB含量明显降低(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组小鼠脑EB浓度和EB含量改变不明显(P＞0.05)，说明中药组合物高、中剂量可以改善阿尔茨海默病小鼠脑BBB通透性。见表9、图9。[0160]表9中药组合物对阿尔茨海默病小鼠脑BBB通透性的影响(n＝8)
[0161]
[0162][0163]
*#**
注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.053.10中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马超微结构的影响
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3.10.1中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马CA1区神经元超微结构的影响
[0165]结果表明，对照组小鼠海马CA1区神经元形态比较规则，细胞核圆形，细胞质丰富，高尔基复合体较丰富，线粒体分布均匀，脂滴和脂褐素较少，粗面内质网清晰可见；模型组小鼠海马CA1区神经元形态比较规则，细胞核圆形且较小，细胞质不丰富，脂滴和脂褐素较多，粗面内质网清晰不丰富；多奈哌齐组小鼠海马CA1区神经元形态尚可，细胞核大而圆，线粒体丰富，内质网较丰富，脂滴和脂褐素较少；中药组合物中剂量组小鼠海马CA1区神经元形态规则，细胞核较大，核膜清晰，细胞质丰富，脂滴和脂褐素较少，线粒体和内质网清晰可见。见图10、见图11、见图12。
[0166]3.10.2中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马CA1区毛细血管超微结构的影响[0167]结果表明，对照组小鼠海马CA1区毛细血管管腔较规则，内皮细胞核清晰可见，基底膜完整，内皮细胞质丰富；模型组小鼠海马CA1区毛细血管管腔不规则，内皮细胞质不丰富，基底膜较完整；多奈哌齐组小鼠海马CA1区毛细血管形态比较规则，内皮细胞质较丰富，线粒体清晰可见，毛细血管管腔内可见红细胞，基底膜完整；中药组合物中剂量组小鼠海马CA1区毛细血管形态较规则，内皮细胞质较少且含有少量空泡，毛细血管管腔内可以见到完整红细胞。见图13、见图14、见图15。
[0168]3.11中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马RAGE、NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1表达的影响
[0169]结果表明，相较于对照组，模型组小鼠海马RAGE、NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1明显增加(P＜0.05)；相较于模型组，多奈哌齐组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠海马RAGE、NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1明显减少(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组小鼠海马RAGE、NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1蛋白平均光密度值改变不明显(P＞0.05)，说明中药组合物高、中剂量可以改善阿尔茨海默病小鼠海马RAGE、NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1蛋白表达。见表10、图16。
[0170]表10中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马RAGE、NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1表达的影响(n＝8，平均光密度值)
[0171]
[0172][0173]
*#**
注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.053.12中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马RAGE、NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1基因表
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达的影响
[0174]结果表明，相较于对照组，模型组小鼠海马RAGE、NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1基因相对表达量明显升高(P＜0.05)；相较于模型组，多奈哌齐组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠海马RAGE、NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1基因相对表达量明显降低(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组小鼠海马RAGE、NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1基因相对表达量改变不明显(P＞0.05)，说明中药组合物高、中剂量可以改善阿尔茨海默病小鼠海马RAGE、NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1基因表达。见表11、图17。
[0175]表11中药组合物对阿尔茨海默病小鼠海马RAGE、NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1基因表达的影响(
[0176]
n＝8，2-ΔΔCt法)
[0177]
*#**
注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05
[0178]3.13中药组合物对阿尔茨海默病小鼠脾指数、胸腺指数、脑指数的影响[0179]结果表明，相较于对照组，模型组小鼠脾指数、胸腺指数、脑指数明显降低(P＜0.05)；相较于模型组，多奈哌齐组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脾指数、胸腺指数、脑指数明显增加(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组小鼠脾指数、胸腺指数、脑指数改变不明显(P＞0.05)，说明中药组合物高、中剂量可以改善阿尔茨海默病小鼠脾指数、胸腺指数、脑指数。见表12、图18。
[0180][0181]
表12中药组合物对阿尔茨海默病小鼠脾、胸腺、脑指数的影响(n＝8)
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注：相较于对照组：P＜0.05；相较于模型组：P＜0.05，P＞0.05
[0183]3.14中药组合物对阿尔茨海默病小鼠心、肝、肾和肺指数的影响[0184]结果表明，相较于对照组，模型组小鼠心、肝、肾和肺指数改变不明显(P＞0.05)；相较于模型组，多奈哌齐组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组小鼠心、肝、肾和肺指数改变不明显(P＞0.05)，说明中药组合物高、中、低剂量对阿尔茨海默病小鼠重要脏器无影响。见表13、见图19。
[0185][0186]
表13中药组合物对阿尔茨海默病小鼠心、肝、肾和肺指数的影响(n＝8)
*#
注：相较于对照组：P＞0.05；相较于模型组：P＞0.05
[0188]3.15中药组合物对阿尔茨海默病小鼠体重的影响[01]结果表明，各组小鼠给药过程中，小鼠体重呈现上升趋势，说明中药组合物高、中、低剂量对阿尔茨海默病小鼠体重无影响。同时与对照组0d、8d、16d、24d、32d、40d小鼠体重比较，模型组0d、8d、16d、24d、32d、40d小鼠体重改变不明显(P＞0.05)；与模型组0d、8d、16d、24d、32d、40d小鼠体重比较，多奈哌齐组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组0d、8d、16d、24d、32d、40d小鼠体重改变不明显(P＞0.05)，也说明中药组合物高、中、低剂量对阿尔茨海默病小鼠体重无影响。见表14、图20。
[0187]
[0190][0191]
表14中药组合物对阿尔茨海默病小鼠体重的影响(n＝8)
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注：相较于对照组：P＞0.05；相较于模型组：P＞0.05。
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