灭菌工艺
杂菌（contaminated microbe）：对于发酵生产过程，除生产菌以外的任何生物微生物。 污染（contamination）：感染杂菌的发酵体系。
污染的后果：杂菌不仅消耗营养物质，干扰发酵过程，改变培养条件，引起溶解氧和培养基黏度降低等变化；还会分泌一些有毒物质，抑制生产菌生长；杂菌分泌酶，分解目标产物或使之失活，产量大幅度下降；噬菌体（phage）的污染引起溶菌；杂菌污染直接影响后续工序的有效进行，甚至是产品的质量。
消毒(disinfection)：指用物理或化学方法杀灭或清除病原微生物（pathogen），达到无害化程度的过程，只能杀死营养体，而不能杀灭芽孢体，杀灭率99.9%以上。
杀菌：杀灭或清除病所有微生物的过程，杀灭率99.9999%以上。
灭菌（sterilization）：是指用物理或化学方法杀灭或清除物料或设备中所有生命物质的技术或工艺过程，达到无活微生物存在的过程，微生物杀灭率99.999999%以上。
灭菌是十分重要的工序，包括培养基、发酵设备及局部空间的彻底灭菌、通入空气的净化除菌。常用的灭菌方法主要有化学灭菌、物理灭菌两类。 10.5.1 常用灭菌方法与原理 10.5.1.1 化学灭菌
化学灭菌是指用化学物质杀灭生物细胞的灭菌操作。常用化学灭菌剂有氧化剂类如高锰酸钾、过氧化氢等，卤化物类如漂白粉、氯气等，有机化合物如70～75%乙醇、甲醛、戊二醛、环氧乙烷、2%新洁尔灭、3～5%石炭酸等。使蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性，细胞死亡。化学灭菌主要适合用于皮肤表面、器具、实验室和工厂的无菌区域的台面、地面、墙壁及局部空间或某些器械的消毒。 10.5.1.2 辐射灭菌
物理灭菌包括使用各种物理条件如高温、辐射、超声波及过滤等进行灭菌，效果好，操作方便，广泛使用。各种物理射线对生物细胞具有杀伤能力，其中以紫外线最常用。原理在于核酸和蛋白质在紫外区有强烈的吸收，DNA吸收紫外线后，会形成嘧啶二聚体，如胸腺嘧啶二聚体，分子之间的交联改变了DNA的功能，从而导致生物细胞死亡。但紫外线穿透力极低，只适宜于表面灭菌，常用于一定空间的空气灭菌，如无菌室、超净工作台等的灭菌。 10.5.1.3 干热灭菌
在高温120℃以上，蛋白质、酶、核酸、生物膜等生物大分子变性、凝聚破坏，甚至是降解，生物细胞破裂，内容物释放，生物体死亡。对于干热灭菌，足够长的时间和足够高的温度，都可以杀灭生物体。干热灭菌效果没有湿热灭菌好，是实验室常用的器皿的方法。工业采用160℃、2h，或170℃、1h干热空气，用于需保持干燥的器械、容器的灭菌。温度越高，时间相应缩短。 10.5.1.4 蒸汽灭菌
湿热灭菌效果优于干热灭菌，原因在于湿热状态下，穿透力强，蒸汽冷凝时释放出大量能量，使蛋白质、核酸等内部的化学键破坏、降解，导致生物体死亡。一般在115～140℃，保持一段时间，可
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以杀死各种生物体。由于蒸汽价格低廉，来源方便，效果可靠，操作控制简便，因此湿热灭菌常用于培养基和设备容器的灭菌。常用条件为115～121℃，压力1×105 Pa，维持15～30min。芽孢是一种休眠体，外面有厚膜包裹，耐热性很强，不易杀灭。因此在设计灭菌操作时，经常以杀死芽孢的温度和时间为指标。为了确保彻底灭菌，实际操作中往往增加50％的保险系数。
灭菌过程中，高温会使营养成分受到一定程度破坏。灭菌活化能大大高于营养物质分解活化能，因此应尽量减少灭菌时间和温度。从微生物死亡动力学方程可以看出，随着温度的升高，微生物的死亡速率加快，而且比营养物质分解速率快得多，因此高温短时灭菌可达到相同灭菌效果，而营养物质破坏大大减少。这就是高温短时灭菌的理论基础。实践证明，在能达到完全灭菌的情况下，采用高温短时灭菌是有效的措施。
培养基的pH、原料成分及泡沫对蒸汽灭菌效果有一定影响。不同原料所含杂菌数量不同，pH在6～8内，蛋白质、糖、油脂等物质的存在，对微生物起包裹作用，使微生物对热的抗性增加，不易死亡。pH在6.0以下，微生物对热较敏感，容易杀死，低pH下灭菌时间可缩短。颗粒的存在容易形成灭菌的死角，泡沫的操作阻碍了蒸汽的流动，并形成隔热层，灭菌效果大大降低。这些因素在灭菌操作中应该予以重视。
10.5.1.5 培养基的过滤除菌
有些培养基成分受热容易分解破坏，不能使用蒸汽灭菌，常常采用过滤器除菌。常见的有蔡氏细菌过滤器、烧结玻璃细菌过滤器和纤维素微孔过滤器等。蔡氏细菌过滤器采用石棉滤板，烧结玻璃细菌过滤器的除菌用规格为小孔径的烧结玻璃。纤维素微孔滤膜有醋酸纤维素和混合纤维素等几种质地，具有一定的热稳定性和化学稳定性，孔径规格为0.1～5μm不等，一般选用0.22μm，进行溶液过滤除菌。
10.5.2 培养基的灭菌 10.5.2.1 分批灭菌操作
将配制好的培养基输入发酵罐内，直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一段时间，再冷却至发酵要求的温度，这一工艺过程称为分批灭菌或实罐灭菌。特点是不需其他的附属设备，操作简便，国内外常用。缺点是加热和冷却时间较长，营养成分有一定损失，罐利用低。为中小型生产企业采用。
使物料溶胀并均匀受热，至90℃以上，通入蒸汽，达到121℃开始计算维持时间，生产中习惯采用30分钟。快速冷却，以减少营养物质的破坏，灭菌结束时，立即通入无菌空气，以维持罐压，然后开启冷却系统进行冷却。
灭菌时间计算
分批灭菌时间包括加热升温、保温和降温冷却三个阶段，灭菌主要在保温阶段实现，但升温和降温阶段也有一定贡献。习惯上，保温阶段的时间为灭菌时间，主要计算灭菌时间和热量。升温是采用夹套、蛇管中通入蒸汽直接加热，或在培养基中直接通入蒸汽加热，或两种方法并用，得以实现。在升温阶段，一般认为100℃以上才能起到灭菌作用，它对灭菌的贡献占20％。保温阶段的贡献占75％，降温阶段的贡献只有5％。总体完成灭菌的周期约3~5小时。
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根据微生物浓度和比死亡速率，通常以耐热芽孢杆菌为对象，可以计算灭菌时间。
对于热量计算，涉及所需蒸汽量。可用温度、传热系数、培养基质量、比热、换热面积进行衡算。空罐灭菌的消耗蒸汽体积为罐体积的4~6倍。
操作过程
排放夹套或蛇行管中凉水，开启排气阀。由空气管通入蒸汽，对培养基加热。夹套通入蒸汽进行间接加热。
在70℃左右时，从取样管、放料管通入蒸汽。
在120℃时，罐压1×105 Pa，打开接种、补料、消泡、酸碱等管阀，排气，并调节进汽和排气量，进行保温维持。料液下的管道都应通入蒸汽，料液上的管道都应排放汽。
保温结束后，依次关闭排气、进汽阀，罐压低于空气压力后，通入无菌空气，夹套通入冷却水降温，使培养基降到所需温度。 10.5.2.2 连续灭菌操作
培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程，即连消。
特点：1）可采用高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少；2）发酵罐利用率低；3）热能利用合理，易于自动化控制；4）不适合粘度大或固形物含量高的培养基的灭菌；5）增加了连续灭菌设备及操作环节，增加染菌几率。6）对压力要求高，不小于0.45MPa，一般为0.45~-0.8MPa。
加热器两种，塔式加热器和喷射式加热器。
塔式加热器：一根多孔蒸汽导管和套管组成。培养基从下端进入，流速0.1m/s，蒸汽从塔顶进入，从小孔中喷出，与培养基激烈混合。塔高2~3m，培养基的停留时间20~30s。
喷射式加热器：培养基从中间管进入，蒸汽从料管周围的环隙进入，在喷嘴处快速混合。国内大多数企业采用。
保温设备包括维持罐和管式维持器两种。用保温材料包裹，不直接通入蒸汽。
料液从维持罐上端连续通入到罐底，维持一定时间后，靠罐压流入冷却器。返混严重。 管式维持器：蛇管状，培养基在管内处于湍流区，活塞流动状态，返混为零。 降温：喷淋式冷却器为主，螺旋板式换热器，板式换热器，真空冷却器等。 操作过程：
配料：配料罐，配制培养基。 预热罐：定容和预加热。70~90℃。
加热器（连消塔）：培养基与蒸汽混合，快速升温达到灭菌温度，126~132℃。 维持罐：维持保温培养基的灭菌时间。5~7min。
冷却管：从维持罐出来的料液经过冷却水管冷却。4~50℃。输入灭菌底发酵罐中。 10.5.3 空气过滤除菌
空气的组成：氧气、二氧化碳、氮气的混合物，其中还有水汽及悬浮的尘埃，包括各种微粒、灰尘及微生物。
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空气严格除菌，达到无菌状态，才能使用。工业中制备大量空气的方法有加热灭菌、静电除菌。在发酵工业中，大多采用过滤介质（filter medium）除菌方法制备无菌空气。 10.5.3.1 原理
微生物体积很小，空气中附着在尘埃上的微生物大小为0.5~5μm。过滤介质可以除去游离的微生物和附着在其他物质上的微生物。其原理在于空气通过过滤介质时，颗粒在离心场产生沉降，同时惯性碰撞产生摩擦黏附，颗粒的布朗运动使微粒之间相互集聚成大颗粒，颗粒接触介质表面，直接被截留。气流速度越大，惯性越大，截留效果越好。惯性碰撞截留起主要作用，另外静电引力也有一定作用。
膜过滤技术已得到发展，膜过滤器也用来空气除菌，常用的滤膜有纤维酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龙膜等。其原理在于微生物和微粒（约0.5~20μm） 等大于滤膜的网眼直径（0.3μm），被直接截留于表面。另外沉降作用和静电吸附对除去微粒和尘埃等也有一定贡献。 10.5.3.2 发酵空气的标准
连续一定流量的压缩无菌空气。空气流量：VVM：单位时间（min）单位发酵液体积（m3）内通入的标准状态下的空气体积（m3），一般在0.1~2.0。压强：压力表显示0.2~0.4MPa，克服下游阻力。空气质量：相对湿度小于70％；温度比培养温度高10~30℃；洁净度100级，或失败率10－3。 10.5.3.3 空气预处理与设备
采风塔：在工厂的上风头，高度一般在10m左右，设计流速8m/s。可建在空压机房的屋顶上。 粗过滤器：安装在空压机吸入口前，前置过滤器。作用是截留空气中较大的灰尘，保护压缩机，减轻总过滤器的负担，也能起到一定除菌作用。介质为泡沫塑料（平板式）或无纺布（折叠式），流速0.1~0.5m/s。要求是阻力小，容灰量大。
空气压缩机：作用是提供空气流动的动力。常用往复式、螺杆式、涡轮式空压机。
空气贮罐：消除压缩空气的脉动，用于往复式空压机。螺杆和涡轮式提供均匀连续空气可省去。设置在空压站附近。
冷却器：空气压缩机出口气温一般在120℃，必需冷却。在潮湿季节，除湿。空气冷却器的传热系数为105W/(m2℃)。采用双程或四程结构，两级串联使用。第一级循环水冷却，第二级低温水（9℃）冷却。设置在发酵车间外。压缩空气每经过1m管道，温度下降0.5~1.0℃。 10.5.3.4 油水分离与设备
气液分离设备：除去空气中油和水，保护过滤介质。旋风分离器和丝网除沫器两类。
旋风分离器，利用离心沉降原理。结构简单，阻力小，分离效率高。压缩空气的速度15~25m/s，切线方向进入旋风分离器，在环隙内做圆周运动，水滴或固体颗粒被甩向器壁，而收集。完全除去20μm以上离子，对10μm离子的分离效率为60~70%。
丝网除沫器：利用惯性拦截原理。对1μm以上的雾滴除去率98％。
空气加热设备：空气相对湿度仍然为100%，需要降到70%以下，才能进入空气过滤器。列管式换热器，空气走管程，蒸汽走壳程。套夹式加热器，空气走管程，蒸汽走夹套。 10.5.3.5 空气过滤介质与设备
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要求除菌效率高，耐受高温高压，不易被油水污染，阻力小，成本低，易更换。常用的介质有棉花、活性炭、玻璃棉、超细比例纤维纸、石棉滤板等。
绝对过滤器：介质孔径小于被截留的微生物体积，如四氟乙烯、纤维素树脂微孔滤膜。 深层过滤器：介质空隙对于被截留的微生物体积，但有一定厚度，靠静电、扩散、惯性、拦截。棉花过滤器、超细玻璃纤维纸、石棉过滤、金属烧结管等。
实验室采用一级过滤器，生产规模设置二、三级过滤器，第一级为总过滤器，二、三级为分过滤器。
纤维及颗粒介质过滤器：圆筒形，直径2.5~3m。孔径10~15mm。空气从下方进入，上方引出。常用介质棉花、玻璃纤维、活性炭等。空气流速0.2~0.3m/s。可作为总过滤器。
过滤器的灭菌：通入蒸汽，0.2~0.4MPa，45min。压缩空气吹干，备用。总过滤器每月灭菌一次。应该有备用过滤器，灭菌时交换使用。
纸过滤器：超细玻璃纤维纸为介质，孔径1~1.5um，厚度0.25~0.4mm，填充率14.8%。除菌效率很高，0.3μm粒子，99.99%。空气流速0.2~1.5m/s。阻力很小。可作为终端过滤器。
金属烧结管过滤器：几十至上百根金属微孔过滤管安装在不锈钢壳体内组成。孔径10~30μm，处理能力达100m3/min。特点：寿命长，耐高温，阻力小，安装维修方便。可作为终端过滤器。
微孔膜过滤器：不锈钢中心柱，滤膜做成折叠型的过滤层，绕在中心柱上，外加耐热的聚丙烯套。特点：体积小，处理量大，压降小，除菌效率高，能除去0.01μm以上粒子。流速0.5~0.7m/s，压降小于100Pa。一般前置空气预过滤器、蒸汽过滤器，延长其使用寿命。膜材料有硼硅酸纤维，预过滤器，除去灰、垢；聚偏二氟乙烯，终端过滤器；聚四氟乙烯，终端过滤。
新型子弹状膜过滤器：过滤膜是“皱褶膜”，体积小，阻力小，过滤面积大，膜易更换。棉花和活性炭填充时，体积大，吸油水能力强。超细玻璃纤维纸除菌效率高，但易被水油污染。新型过滤器将取代传统过滤器。
10.5.3.6 空气过滤除菌的工艺流程
为了获得无菌空气，一般采用三个主要工段。
（1）提高空气的洁净度：前过滤器可减少压缩机活塞和气缸的磨损，减少介质负荷。
（2）除去空气中油和水：采用分级冷却，一级冷却采用30℃左右的水使空气冷却到40~50℃，二级冷却器采用9℃冷水或15~18℃地下水，使空气冷却到20~25℃。冷却后，空气湿度提高了100％，湿度处于露点以下，油和水凝结成油滴和水滴，在空气贮藏罐内沉降大液滴。旋风分离器分离5μm以上的液滴。丝网除沫器分离5μm以下液滴。
（3）获得无菌空气：分离油水后的空气湿度仍然达100％，温度稍下降，就会产生水滴，使介质吸潮。加热提高空气温度，降低湿度（60％以下）。这样空气温度达30~35℃，经过总过滤器和分过滤器除菌后，得到符合要求的无菌空气。 10.5.4 无菌检查与杂菌控制
杂菌的检测与控制是十分重要的，杂菌的污染将严重影响产量和质量，甚至倒罐。
杂菌检测的主要方法为显微镜检测和平板划线检测两种，显微镜检测方便快速及时，平板检测需
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要过夜培养，时间较长。检测的原则是每个工序或一定时间进行取样检测，确保下道工序无污染。
发酵污染杂菌的原因复杂，但归结起来主要有种子污染、设备及其附件渗漏、培养基灭菌不彻底、空气带菌、技术管理不善等几方面。 10.5.4.1 无菌试验方法与染菌的判断
肉汤培养法：用装有酚红肉汤的无菌试管取样，放入37℃恒温培养。 斜面培养法：空白无菌试管取样，接种于斜面培养基，37℃培养。 种子罐和发酵罐每隔8小时取样一次。
以酚红肉汤反应和双碟检查为主，镜检为辅。连续3个时间的酚红肉汤无菌样发生颜色变化，或双碟上连续3个时间样品长出杂菌，即判断为染菌。酚红肉汤不明显，要结合镜检。 10.5.4.2 培养基灭菌不彻底及其控制
培养基灭菌不彻底是常见的导致发酵过程被污染杂菌的原因。最主要原因是由于蒸汽压力或用量不足、灭菌时间不够引起的，灭菌时产生大量泡沫、有难溶固体颗粒或罐内污垢堆积也会直接影响了灭菌效果，另外设备制作或安装不当，蒸汽不能到达，造成灭菌死角。
根据造成灭菌不彻底的原因，可采取相应的措施。保证灭菌所需的蒸汽压力、用量和时间。为了防止产生大量泡沫，升温时间不宜太快，要适当；含糖和含氮培养基可分开灭菌，进气和排气阀门开启要缓慢。
10.5.4.3 空气带菌及其控制
空气过滤器效能下降，除菌失败，导致通入污染空气。空气除菌环节较多，每一个环节的失控就会导致灭菌失败。包括管件穿孔与渗漏带入杂菌和过滤介质松动、老化、吸潮等，使过滤除菌性能下降所致。
可通过定期检查管件、更换过滤介质和加强检修来解决。 10.5.4.4 设备及其附件渗漏引起的污染及其控制
发酵设备及其附件的渗漏是化学和电化学腐蚀、机械磨损共同作用引起的，一旦设备及其附件的渗漏，就会引起污染。冷凝蛇管和夹套的穿孔渗漏，会使冷却水污染杂菌。阀门渗漏，外界的空气或水会进入发酵罐，引起污染。
对于设备失修、渗漏引起杂菌污染，要建立并执行完善的管理制度、操作制度与规程，加强技术设备管理，定期检修和维护发酵设备及各个环节，杂菌污染是可以杜绝的。一旦发现污染，要及时处理。
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