天津医科大学 研究生读书报告表
学位级别： □博士 □硕士 学位类型： □学术型 □专业型 学 号： 所有表格必须手写填写 姓 名： 专 业： 指导教师： 培养单位： 完成时间：
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抗CD47 单克隆抗体对卵巢癌细胞靶向治疗的体外研究 中文题目 In vitro application of anti-CD47 monoclonal antibody for targeted therapy of ovarian cancer 英文题目 通讯作者 郝权 期刊/出处 中国肿瘤临床 研究背景、意义 研究背景: 卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，其发病率居第3位，但死亡率却高居首位。尽管在现有的治疗中，经过肿瘤细胞减灭术和化疗等治疗手段在短期中得到有效缓解，但80%～85%患者会出现耐药及复发，最终导致临床治疗的失败。而其治疗的最大障碍是肿瘤细胞耐药性的产生，深入研究卵巢癌肿瘤细胞的生物学行为及发现新的靶向药物对卵巢癌的治疗具有重要意义。CD47又称整合素相关蛋白，广泛表达于机体各类细胞表面，是抑制性受体人信号调节蛋白α（sig⁃nal-regulatory protein alpha，SIRPα）的胞外配体，而SIRPα主要表达于巨噬细胞、树突状细胞和神经细胞表面，CD47与SIRPα结合引起SIRPα中酪氨酸磷酸化，传导抑制性信号即“别吃我”信号而降低巨噬细胞的吞噬活性，从而对固有免疫系统产生抑制作用。既往在白血病、乳腺癌、膀胱癌、非霍奇金淋巴瘤等恶性肿瘤的研究中发现CD47呈高表达状态，应用抗CD47单克隆抗体能够特异性的作用于肿瘤细胞促进巨噬细胞的吞噬作用。 研究意义：应用抗CD47单克隆抗体对卵巢癌是否具有靶向治疗作用目前尚处于初步研究，本研究从体外实验为卵巢癌的靶向治疗提供实验依据。 研究内容 （一）方法 1.1 细胞培养 人卵巢组织细胞的获得：临床手术取得的正常卵巢组织和卵巢癌组织于超净台中，将组织剪成碎片后加入300 U/mL的胶原酶Ⅱ和透明质酸酶，于37℃水浴箱中消化30～60 min，经PBS缓冲液冲洗、通过70 μm滤器获得单细胞悬液备流式分析用。小鼠巨噬细胞的获得/培养：脱颈处死6～8周龄昆明品系小鼠，经75%酒精浸泡后向腹腔注入无血清DMEM培养液，静置5～7 min后无菌条件下切开小鼠腹腔，用注射器抽取腹腔液经离心洗 涤后显微镜下计数，调整细胞密度至5×104个/mL接种于含完全培养基的24孔板内，置于37℃、5%CO2培养箱中培养2 h后备实验用。 1.2 流式细胞术检测CD47的表达 将上述获得的卵巢组织单细胞细胞悬液经PBS-EDTA 缓冲液（PBE）清洗去除上清，用100 μL PBE重悬细胞制成两份标本。一份标本（空白管）不加抗体用作空白对照；另一份标本（样品管）加入鼠抗人CD47-FITC单克隆抗体5 μL，混匀，4℃孵育30 min；PBE清洗1次，重悬于0.5 mL PBE中用于流式分析检测（计数105个细胞用于分析）。 1.3 细胞功能实验 制备人卵巢癌细胞系SKOV-3单细胞悬液，将显示绿色荧光的CFSE（1 μm/mL，严格按照说明书避光操作）标记于SKOV-3细胞上，调整细胞密度至2×105个/mL接种于上述备实验用的巨噬细胞中。加入功能实验用鼠抗人CD47单克隆抗体、鼠抗人HLA单克隆抗体、鼠IgG1同型对照抗体于孵箱中与小鼠巨噬细胞共培养2 h，吸弃上清液，PBS清洗2次，于荧光显微镜下计数被吞噬的肿瘤细胞。结果判断：吞噬指数=被吞噬的CFSE标记的卵巢癌细胞/100个巨噬细胞。 （二）实验结果 2.1 不同卵巢组织细胞中CD47的表达水平及其与临床病理参数的关系 流式细胞仪结果分析显示，正常人卵巢上皮细胞中CD47呈低表达，卵巢癌组织细胞和SKOV-3中 CD47呈高表达，均高于正常人卵巢上皮细胞，差异具有统计学意义（P<0.01）。分析CD47表达水平与临床病理参 - 1 -
数的关系可见其与患者的年龄、病理类型、临床分期无统计学意义，与分化程度相关，差异具有统计学意义（P=0.046）。 2.2 抗CD47单克隆抗体对巨噬细胞的促进吞噬作用 小鼠巨噬细胞与卵巢癌肿瘤细胞共培养的体外实验表明，抗CD47单克隆抗体可明显促进巨噬细胞对卵巢癌肿瘤细胞的吞噬作用，同抗体本身的作用及HLA抗体机制介导的免疫作用无关。随着所用抗体浓度的改变，其吞噬指数呈明显的剂量依赖关系。5 μg/mL 抗CD47 组巨噬细胞的吞噬指数（0.28±0.02）较对照组增加，明显强于1 μg/mL 抗CD47组0.17±0.02，差异具有统计学意义（P<0.01）。同样，10 μg/mL 抗CD47 组巨噬细胞的吞噬指数（0.39±0.02）较对照组增加，明显强于5 μg/mL 抗CD47组，差异具有统计学意义（P<0.01）。20 μg/mL抗CD47组巨噬细胞的吞噬指数（0.40±0.01）较对照组增加，与10 μg/mL抗CD47组对巨噬细胞的促吞噬作用比较无显著性差异（P=0.235）。荧光显微镜下清晰的看出CFSE标记的卵巢癌细胞系SKOV-3细胞被小鼠巨噬细胞吞噬。 评价与分析（不少于500字） 本研究探讨了抗CD47单克隆抗体在体外对巨噬细胞吞噬卵巢癌细胞作用的影响。收集45例卵巢组织，通过流式细胞术分析CD47的表达水平，通过细胞功能学实验观察抗CD47单克隆抗体在体外对小鼠巨噬细胞吞噬卵巢癌细胞的靶向治疗作用。实验结果显示，CD47高表达于卵巢癌组织细胞，且与组织分化程度相关。抗CD47单克隆抗体在体外可促进巨噬细胞对卵巢癌肿瘤细胞的吞噬作用，进一步研究发现，10 μg/mL浓度组吞噬指数达到峰值，同20 μg/mL浓度组吞噬指数无显著性差异（P>0.05）。为卵巢癌的靶向治疗提供了实验依据。 CD47与SIRPα结合引起SIRPα中酪氨酸磷酸化，传导抑制性信号而降低巨噬细胞的吞噬活性，从而对固有免疫系统产生抑制作用。本研究结果不但证实CD47在卵巢癌组织细胞呈现高表达状态，与已研究的结果相一致，并且进一步证实其与卵巢癌的分化程度相关。提示CD47的表达水平与肿瘤的恶性程度具有相关性。而进一步体外细胞功能学实验结果表明，应用抗CD47单克隆抗体在荧光显微镜下可清晰的看出经CFSE 标记的卵巢癌细胞系 SKOV-3肿瘤细胞被小鼠巨噬细胞吞噬。通过计算吞噬指数，与对照组相比，实验组应用抗CD47单克隆抗体后巨噬细胞的吞噬作用得到显著增强。并且随着所用抗体浓度的改变，其吞噬指数呈明显的剂量依赖关系，即抗体浓度越高，吞噬指数越大，吞噬功能越强，当抗体浓度为10μg/mL时吞噬功能达到峰值，这可能与抗体浓度达到饱和的状态有关。 本研究结果证实CD47与卵巢癌肿瘤细胞的抗巨噬细胞吞噬作用有着显著的关系，应用抗CD47单克隆抗体能够显著增强巨噬细胞的吞噬作用，同抗体本身的作用及HLA抗体机制介导的免疫作用无关，由此可见在卵巢癌中肿瘤细胞逃避机体免疫系统的杀伤也是通过CD47-SIRPα这一通路的介导实现的。给我们的提示：应用CD47单克隆抗体在肿瘤的靶向治疗中显示了强大的治疗作用，或许能为肿瘤治疗的发展带来新的曙光。 不足之处： 首先，本研究病例仅为45例，所得结果、结论需要进一步证实，另外所得阴性结果，如然而统计分析表明CD47的表达水平与患者的年龄、病理类型、临床分期无统计学意义，可能与本实验样本量尚不充足有关，需大样本、多中心实验进行进一步的验证。 另外，在本研究于体外实验中发现，应用抗CD47单克隆抗体可显著增强巨噬细胞对卵巢癌肿瘤细胞的吞噬作用，而在体内实验中应用抗CD47单克隆抗体是否能够同样取得显著的效果尚需要进一步的研究证实。 - 2 -
指标 文献 评价内容 评价等级 优 良 中 差 得分 文献选取的权威性和学术性，与指定研究方向结合密（20分） 切程度，阅读价值 内容 领悟文献的内容、观点，准确阐释研究背景、研究价（30分） 值、意义以及在学术中的地位 观点 对文献相关问题进行思索，分析深入，评价、论（30分） 证充分，得出的结论具有科学性 规范 文笔流畅、表达清晰、文字准确，学术规范，具有语（20分） 言和专业功底 20-16 15-11 10-6 5-0 30-24 23-16 15-8 7-0 30-24 23-16 15-8 7-0 20-16 15-11 10-6 5-0 评审 意见 总评 成绩 评审 日期 导师签名： 注：1.总评成绩以70分为合格，≥70分可计学分。
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