DHODH缺失对线粒体功能和成骨细胞分化成熟影响的研究

１３１２　重庆医学２０１７年４月第４６卷第１Ｏ期　论著・基础研究ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１—８３４８．２０１７．１０．００５　ＤＨＯＤＨ缺失对线粒体功能和成骨细胞分化成熟影响的研究　方静娴　，钱　虹　，刘河娣　，唐　翔。△　（１．南方医科大学口腔医院／广东省口腔医院儿童牙科，广州５１０２８０；　２．广州医科大学附属第二医院妇科，广州５１０２６０）　［摘要］　目的探讨二氧乳清酸脱氢酶（ＤＨＯＤＨ）缺失对线粒体功能和成骨细胞分化成熟的影响。方法　通过特异性小干　特异性ｓｉＲＮＡｓ降低ＤＨＯＤＨ表达后，细胞增殖受抑制、细胞周期停滞于Ｇ　／ｓ期。全细　扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）技术抑制小鼠胚胎成骨细胞前体细胞ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１细胞中ＤＨＯＤＨ表达后，观察细胞增殖、三磷酸腺苷（ＡＴＰ）产　量及骨发育相关基因表达水平。结果胞ＡＴＰ产量，特别是线粒体来源的ＡＴＰ减少。与对照组相比，ＤＨＯＤＨ抑制组中Ｒｕｎｔ相关转录因子２（Ｒｕｎｘ２）及骨钙素（Ｏｃｎ）　的ｍＲＮＡｓ表达量降低。结论抑制ＤＨＯＤＨ蛋白影响成骨细胞的分化与成熟。成骨细胞中线粒体功能异常可能是导致米勒　综合征骨发育异常的原因之一。　［关键词］二氢乳清酸脱氢酶；线粒体；成骨细胞；米勒综合征　［中图分类号］　Ｒ７８　［文献标识码］　Ａ　［文章编号］　１６７１—８３４８（２０１７）１０—１３１２—０３　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＤＨ０ＤＨ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｎ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｃｅｌｌｓ　Ｆａｎｇ　Ｊｉｎｇｘｉａｎ　，Ｑｉａｎ　Ｈｏｎｇ　，Ｌｉｕ　Ｈｅｄｉ　，Ｔａｎｇ　Ｘｉａｎｇ　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ，Ｓｔｏｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｓｔｏｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　５１０２８０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｇｕ．ａｎｇｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　５１０２６０，Ｃｈｉｎａ）　￣Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｋｅｌｅｔａｌ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ａｆｔｅｒ　ｄｉｈｙｄｒｏｏｒｏｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　（ＤＨ０ＤＨ）ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ＤＨ０ＤＨ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１　ｃｅｌｌｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｍｏｕｓｅ　ｃａｌｖａｒｉａ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｂｙ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ），ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ＡＴＰ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｂｏｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅｓｅ　ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｆｔｅｒ　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ＤＨ０ＤＨ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｉＲＮＡｓ，ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ｗａｓ　ａｒｒｅｓｔｅｄ　ａｔ　Ｇ１／ｓ　ｓｔａｇｅ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ＡＴＰ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｉｎ　ｗｈｏｌｅ　ｃｅｌｌｓ，ａｓ—　ｐｅｃｉａｌｌｙ　ｉｎ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　Ｒｕｎｔ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　２（Ｒｕｎｘ２）ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ（Ｏｏｎ）　ｍＲＮＡｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＤＨＯＤＨ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ＤＨＯＤＨ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｆｆｅｃｔｓ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ．Ｔｈｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ　ｍａｙ　ｂｅ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｃａｕｓｅｓ　ｌｅａｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｂｎｏｒｍａｌ　ｂｏｎｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｍｉｌｌｅｒ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ．　［－Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　ｄｉｈｙｄｒｏｏｒｏｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ；ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｃｅｌｌｓ；Ｍｉｌｌｅｒ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　米勒综合征由二氢乳清酸脱氢酶（ｄｉｈｙｄｒ０ｏｒｏｔａｔｅ　ｄｅｈｙ—　ｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＤＨＯＤＨ）突变所致＿１。］。ＤＨＯＤＨ是嘧啶从头合成　本血清（ａＭＥＭ）之中，置于５　ＣＯ　浓度的３７℃细胞培养箱　中。细胞长满续代时使用ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，　ＣＡ，美国），并将１×１０　细胞再植于含ａＭＥＭ／１０　胎牛血清　（ＦＢＳ）的２４孑Ｌ板中。　途径生物合成途径中惟一在线粒体内发生作用的限速酶［４　］。　线粒体产生三磷酸腺苷（ＡＴＰ）并调节细胞生长、分化、凋亡以　及其他多重代谢途径【５　］。前期研究通过海拉（ＨｅＬａ）细胞已　证明，ＤＨ０ＤＨ突变影响了线粒体功能进而影响了米勒综合征　的病理发生＿７　。然而，目前仍不清楚ＤＨＯＤＨ缺失如何最终　导致米勒综合征的发生。米勒综合征的许多临床症状与骨发　育相关，本研究采用成骨细胞前体细胞（Ｍｃ３Ｔ３一Ｅ１），通过特　殊小干扰ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）抑制ＤＨＯＤＨ，观察抑制后成骨细　胞内和线粒体的变化，旨在探索成骨细胞中ＤＨＯＤＨ功能异　常是否与米勒综合征发生相关。　１材料与方法　１．２抗体及试剂ＤＨＯＤＨ抗体受赠于日本九州大学医学院　临床检查部分子生物学检查室。０一ａｃｔｉｎ抗体购于美国Ｓｉｇｍａ　ｃｙｃｌｉｎｅＢ１，ｐ５３抗体购于美国Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ。细胞周期依赖蛋白　激酶Ｃｄｋｌ／Ｃｄｃ２（ＣＤＣ２）以及磷酸化视网膜母细胞瘤（ｐｈｏｓ—　ｐｈｏ—ＲＢ）抗体购于美国Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ。　１．３方法　１．３．１　ｓｉＲＮＡｓ法抑制蛋白表达　两组２５　ｂｐ双链ＤＨ０ＤＨ—　ｓｉＲＮＡ订购于ＳｔｅａｌｔｈＳｅｌｅｅｔＲＮＡｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，美国）。ＤＨ（）ＤＨ及　对照组ｓｉＲＮＡ序列及转染方法参见文献［７］。　１．３．２　细胞增殖测定　为检测抑制ＤＨＯＤＨ后细胞增殖受　影响情况，ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞转染ＤＨＯＤＨ　ｓｉＲＮＡ或对照组ｓｉＲ—　ＮＡ后以１×１０　浓度转入２４孔板中培养，培养液含ａＭＥＭ及　１．１　细胞培养　小鼠头颅成骨细胞前体细胞，ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细　胞受赠于日本九州大学牙学院解剖教研室。ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１细胞　培养于包含１Ｏ　热失活胎牛血清以及１　青霉素／链霉素的基　＊　基金项目：广东省自然科学基金资助项目（２０１５Ａ０３０３１０１０５）；广州市卫生局医药卫生科技项目（２０１６１Ａ０１１０７０）；广州医科大学博士科研　启动项目（２０１４Ｃ３４）。　作者简介：方静娴（１９８３一），主治医师，博士，主要从事口腔内科学及口腔遗传病学基础与临床研究。　Ｅ—ｍａｉｌ：２１５５８０３４＠ｑｑ．ｃｏｍ。　通信作者，　重庆医学２０１７年４月第４６卷第１Ｏ期　表１　ＲＴ—ＰＣＲ引物列表　ｌ３１３　透析１Ｏ　ＦＢＳ。每组重复３次。细胞培养至７２　ｈ，每日脱壁收　集，用ＣｏｕｈｅｒＣｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ，美国）计数。　产量显著较对照组低（图１Ｄ）。此外，经寡霉素（Ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎ），　线粒体氧化呼吸链复合体Ｖ抑制剂处理后，所有实验组中　ＡＴＰ产量均大大减低（图１Ｄ）。这些数据显示ＤＨ０ＤＨ缺失　可导致成骨细胞前体细胞中线粒体功能异常，而这也补充完善　１．３．３蛋白印记　ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１细胞裂解于ＴＮＥ裂解液Ｅ５ｏ　ｍｍｏｌ／Ｌ三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）／ＨＣ１，ｐＨ　７．５，１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，１５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，０．５　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０￣。每组上样２Ｏ　ｕｇ蛋白于ＳＤＳ电泳胶中，并用相应抗体进行免疫阻断。检测、　分析方法及工具参见文献［７］。　１．３．４　ＡＴＰ定量分析细胞ＡＴＰ产量通过ＡＴＰ检测试剂　盒测量，依照生产厂商使用说明（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ｗＩ，美　国）。细胞裂解于被动裂解液中（Ｐｒｏｍｅｇａ）并以相同反应量加　入反应中。裂解液中的发光量依照每份裂解液中所含蛋白量　均化后检测计算。所得ＡＴＰ值按线性标准曲线来确定。　１．３．５　ＲＮＡ提取及ＲＴ－ＰＣＲ分析经ＤＨＯＤＨ　ｓｉＲＮＡ转染　７２　ｈ后，ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞的ＲＮＡ依照生产厂商使用说明通过　Ｔｒｉｚｉｏｌ试剂盒（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）裂解收集。所有ＲＮＡ均使用无核　糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）处理，并使用ＲＮｅａｓｙ—　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｍａｉｎｚ，德国）纯化。用１　ｂｔｇ　ＲＮＡ经ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ　（Ｔｏｙｏｂｏ，０￣ｓａｋａ，日本）合成ｃＤＮＡ后，用ＱｕｉｃｋＴａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏ—　ｇｅｎ）ＰＣＲ扩增出小鼠Ｒｕｎｔ相关转录因子２（Ｒｕｎｘ２）、骨钙素　（Ｏｃｎ）以及３一磷酸甘油醛脱氢酶（Ｇａｐｄｈ），再将ＰＣＲ产物置于　２　琼脂糖凝胶中电泳。电泳结果用溴化乙锭染色显影，基因　表达状态用ＮＩＨ　ｉｍａｇｅ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．．ｇｏｖ／ｎｉｈ－‘ｉｍａｇｅ／）　定量。相关小鼠序列引物及ＰＣＲ反应条件见表１。　１．４统计学处理采用ＳＰＳＳ１８．０进行统计分析，计量资料　用　±Ｓ表示，组间比较分析使用Ｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ检验，或在适当的　情况下采用配对ｔ检验。检验水准口一０．０５，以Ｐ＜０．０５为差　异有统计学意义。　２结　果　２．１干扰ＤＨＯＤＨ　ＲＮＡ后目标蛋白表达受影响　分别使用　两种不同ＤＨＯＤＨ　ｓｉＲＮＡ处理成骨细胞前体细胞７２　ｈ后，　ＤＨＯＤＨ蛋白量在ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞中生成量减少，而细胞内　ａｃｔｉｎ表达量并未受影响（图１Ａ）。对照ｓｉＲＮＡ用以检测　ＤＨＯＤＨ　ｓｉＲＮＡ作用的特异性，在该组中并未检测到　ＤＨＯＤＨ及　－ａｃｔｉｎ表达量受到影响（图１Ａ）。　２．２抑制ＤＨＯＤＨ蛋白表达后细胞增殖受影响　每组处理　后ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞数值使用Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＣｏｕＩ—　ｔｅｒ）计数，结果发现ＤＨＯＤＨ　ｓｉＲＮＡ处理组中细胞增殖速度较　对照组降低（图１Ｂ）。　２．３抑制ＤＨＯＤＨ后对细胞周期的影响　在抑制ＤＨＯＤＨ　表达后，ＣＤＣ２，ｃｙｃｌｉｎｅＢ１以及ｐｈｏｓｐｈｏ－一ＲＢ在ＭＣ３Ｔ３Ｅ１中的　表达量有少量减少，而ｐ５３蛋白量少量增加，提示经ＤＨＯＤＨ　ｓｉＲＮＡ处理后ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞可能停滞于Ｇ　／ｓ期（图１Ｃ）。　２．４抑制ＤＨＯＤＨ后细胞及线粒体ＡＴＰ产量减少　细胞转　染处理后，不同ＤＨＯＤＨ　ｓｉＲＮＡ组均显示较低的ＡＴＰ产量，　该现象在ＤＨ０ＤＨ　ｓｉ＃１组中尤为明显（图１Ｄ）。ＭＣ３Ｔ３Ｅｌ　细胞中ＤＨＯＤＨ　ｓｉ＃１和ｓｉ＃２转染组中，源于线粒体的ＡＴＰ　了基于ＨｅＬａ细胞对米勒综合征的研究　。　．　匦圈豳嘲１　柏ｈ■■＿｝哪”　７２　墨麓圈豳Ｊ　ｎ鬯笪豳趟麓翻ｌ　匿垂塑随　豳■■圈Ｊ｝　　匝豳圜困夔豳∞键　匮豳蕊圈豳ｃｖｃＩ　ｉｎｅ　Ｂ１　巨三匣国王　ｐｈｏ。　一ＲＢ　巨虽叵弓三日艏ａ　￣－ａｃｔｉｎ　２ｏ０ｌＤ　０翟　Ａ：两种不同ＤＨＯＤＨ蛋白ｓｉＲＮＡ（ＤＨＯＤＨ　ｓｉ＃１和ＤＨＯＤＨ　ｓｉ　＃２）转染ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１细胞后ＤＨＯＤＨ蛋白表达量；Ｂ：ｓｉＲＮＡ转染后　ＭＣ３Ｔ３－－Ｅｌ细胞增殖状况；Ｃ：转染ＤＨＯＤＨ　ｓｉＲＮＩＡ　７２　ｈ后ＭＣ３Ｔ３－。Ｅ１　细胞周期相关蛋白的表达情况；Ｄ：转染ＤＨＯＤＨ　ｓｉＲＮＡ后ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１　细胞ＡＴＰ产量变化情况；　：Ｐ＜０．０５。　图１　转染抑制ＤＨ０ＤＨ表达后所产生的影响　２．５成骨基因的表达ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞中ＤＨＯＤＨ表达受抑　制后，Ｒｕｎｘ２及Ｏｃｎ基因表达量均显著降低（图２），从而说明　ＤＨＯＤＨ减少后正常骨形成过程受干扰。　０　Ｒｕｎｘ２　Ｃ，ｏｎｔｒｏｌ　ｓｉ　Ｄ｝ＩＯＤＨ　０；＃ｌ　ＤＨ０ＤＨ　ｓ；＃２　矗富　■—■●ｏ－ｅｃａｎ　砉：ｌ■一一　１３１４　重庆医学２０１７年４月第４６卷第１Ｏ期　论　３讨　了ＤＨＯＤＨ很有可能参与了成骨细胞的分化与成熟。因此，　ＤＨ０ＤＨ蛋白减少或缺失所引起的成骨细胞功能障碍有可能　ＤＨＯＤＨ是一种含铁的黄素依赖的线粒体酶，是核酸中嘧　啶合成的关键酶，其作用是催化嘧啶从头生物合成途径中的第　四步反应。ＤＨＯＤＨ是免疫相关疾病的重要靶点『ｇ］。抑制　与米勒综合征的发生和临床症状相关。　颌面部骨发育障碍仅是米勒综合征发病机制的一个方面，　若要进一步阐明米勒综合征发生分子机制，仍需从其他组织或　细胞包括神经嵴细胞领域深入研究。　参考文献　ＤＨＯＤＨ，可以阻断新生嘧啶合成，致使ＤＮＡ合成障碍，抑制　活化的Ｔ淋巴细胞、Ｂ淋巴细胞以及肿瘤细胞的增殖，从而在　免疫抑制和抗肿瘤中起重要作用。ＤＨＯＤＨ抑制剂来氟米特　已经成功应用于自身免疫性疾病如红斑狼疮、类风湿性关节炎　和肾病综合征等的临床治疗。另一种ＤＨＯＤＨ抑制剂布喹那　已经分别完成了抗肿瘤和器官移植免疫抑制的Ⅱ期临床试　验　。此外，嘧啶补救途径的缺失使疟原虫完全依赖于　ＤＨＯＤＨ参与的嘧啶从头合成途径，因此对ＤＨＯＤＨ抑制剂　敏感。而人类细胞却可通过嘧啶补救途径获取维持细胞生长　所需的嘧啶，故ＤＨＯＤＨ还是理想的抗疟药新靶点。　［１］Ｔｒａｉｎｏｒ　ＰＡ，Ａｎｄｒｅｗｓ　ＢＴ．Ｆａｃｉａｌ　ｄｙｓｏｓｔｏｓｅｓ：ｅｔｉｏｌｏｇｙ，　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｇｅｎｅｔ　Ｃ　Ｓｅｍｉｎ　Ｍｅｄ　Ｇｅｎｅｔ，２０１３，１６３（４）：２８３—２９４．　ｅｍｅｎｔ　ＫＡ，Ｂｌａｃｋ　ＪＳ，Ｄｅｎｎｙ　ＡＤ．Ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ　ｏｆ．ｄｉｓｔｒａｃ—　［２］　Ｋｌｔｉｏｎ　ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ　ｓｋｅｌｅｔｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｒａｎｉｏｆａｃ　Ｓｕｒｇ，２０１６，２７（３）：５６５－５７０．　然而关于ＤＨＯＤＨ与骨发育的研究鲜有报道。基于米勒　综合征的多项症状涉及骨骼发育，而ＤＨＯＤＨ又是该病的致　病基因，所以本研究将抑制ＤＨＯＤＨ后成骨细胞前体细胞相　ｎｇｈａｍ　ＫＪ，Ｌｅｅ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｉ—　［３］　Ｎｇ　ＳＢ，Ｂｕｃｋｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ　ｔｈｅ　ｃａｕｓｅ　ｏｆ　ａ　ｍｅｎｄｅｌｉａｎ　ｄｉｓｏｒｄｅｒ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ，　２０１０，４２：３０—３５　关变化作为研究内容。米勒综合征是常染色体隐性遗传或伴　发复合杂合型突变＿３］。目前认为ＤＨＯＤＨ突变是导致该疾病　ｉａｎ　ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　［４］　Ｅｖａｎｓ　ＤＲ，Ｇｕｙ　ＨＩ．Ｍａｍｍａｌｆｒｅｓｈ　ｉｎｓｉｇｈｔｓ　ｉｎｔｏ　ａｎ　ａｎｃｉｅｎｔ　ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ￣．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，　２００４，２７９：３３０３５—３３０３８．　的致病原因＿３］，并阻断了米勒综合征患者胚胎发育中第一和第　二鳃弓的发育［１　］。米勒综合征由ＤＨＯＤＨ功能异常所致并　与骨骼结构异常相关。作者前期研究中观察了源白宫颈癌的　ＨｅＬａ细胞中ＤＨＯＤＨ的功能＿７　］，并发现在ＨｅＬａ细胞中　ｄｅ　ＨＭ，Ｎｅｕｓｐｉｅ１　Ｍ，Ｗａｓｉａｋ　Ｓ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：ｍｏｒｅ　［５］　ＭｅＢｒｉｔｈａｎ　ｊｕｓｔ　ａ　ｐｏｗｅｒｈｏｕｓｅ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏｌ，２００６，１６：５５１—５６０．　ｃｈｅｌｅ　Ｒ．Ｃａｒｉｍｉ　Ｆ。Ｆｒｏｍｍｅｒ　ＷＢ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ１　ｂｉｏ—　［６］　Ｄｅ　ＭｉＤＨＯＤＨ缺失可导致线粒体功能异常和细胞周期停止，从而推　ｓｅｎｓｏｒｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，２０１４，４８：３９—４４．　　Ｔ，Ｙａｇｉ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｈｙｄｒｏ—ｏｒｏｔａｔｅ　ｄｅｈｙ—　［７］　Ｆａｎｇ　Ｊ，Ｕｃｈｉｕｍｉｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｉｓ　ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｌｏｓｓ　ｌｅａｄｓ　ｔｏ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ　论出ＤＨＯＤＨ功能缺失导致线粒体功能障碍，对米勒综合征　发生产生作用。尽管前期研究中，分析了ＤＨＯＤＨ在癌细胞　中的功能　但其在涉及骨骼结构的细胞中所发挥的分子机制并　没有被完全发现。　因此，在本研究中，通过使用成骨细胞前体细胞试图阐明　ＤＨＯＤＨ在这些细胞中的作用并寻找米勒综合征的发病机制。　合成ＡＴＰ为细胞提供能量是线粒体的主要功能之一。　ＤＨＯＤＨ是嘧啶合成途径中惟一定植于线粒体中的限速酶。　而当尿苷磷酸合酶（ＵＭＰＳ），ＤＨＯＤＨ后续限速酶编码基因，　突变时其所导致的临床表现型却与米勒综合征的临床表现不　同。在ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞，小鼠头颅成骨细胞前体细胞中，　ＤＨＯＤＨ抑制组较对照组，细胞繁殖减缓，细胞内ＡＴＰ产量，　Ｉ－Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉ　Ｒｅｐ，２０１３，３３（２）：ｅ０００２１．　ｕｍｉ　Ｔ，Ｙａｇｉ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　［８］　Ｆａｎｇ　Ｊ，Ｕｃｈｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｄｉｈｙｄｒｏ—ｏｒｏｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｉｎ　Ｍｉｌｌｅｒ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　Ｅ　Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉ　Ｒｅｐ，２０１２，３２（６）：６３１－６３９．　［９］Ｓｙｋｅｓ　ＤＢ，Ｋｆｏｕｒｙ　ＹＳ，Ｍｅｒｃｉｅｒ　ＦＥ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉ—　ｈｙｄｒｏｏｒｏｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｂｌｏｃｋａｄｅ　ｉｎ　ａｃｕｔｅ　ｍｙｅ！ｏｉｄ　ｌｅｕｋｅｍｉａ［Ｊ］．Ｃｅｌ１．２０１６，１６７　（１）：１７１－１８６．　特别是线粒体来源ＡＴＰ产量降低。明确了线粒体功能异常很　可能导致米勒综合征中骨骼结构发育异常。　Ｒｕｎｘ２是转录因子，也是间充质干细胞分化成为成骨细胞　的必须主基因。骨钙素由成骨细胞分泌并参与促进骨形　成＿１　。因此这些基因对于成骨细胞的分化与成熟发挥着重要　Ｉ－ｌｏ］Ｈｅ　Ｔ，Ｈａａｐａ－Ｐａａｎａｎｅｎ　Ｓ，Ｋａｍｉｎｓｋｙｙ　ＶＯ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｈｉｂｉ～　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｏｒｏｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒ０ｇｅｎａｓｅ　ｂｙ　ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ　ａｎｄ　ｂｒｅｑｕｉ—　ｎａｒ　ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｔＯ　ＴＲＡＩＬ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　［Ｊ］．０ｎｃｏｇｅｎｅ，２０１４，３３（２７）：３５３８—３５４９．　作用。当ＭＣ３Ｔ３Ｅ１细胞中ＤＨＯＤＨ受抑制时，骨钙素基因　［１１］Ｖａｌｅｎｔｉ　ＭＴ，Ｄａｌｌｅ　Ｃａｒｂｏｎａｒｅ　Ｌ，Ｍｏｔｔｅｓ　Ｍ．Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｅａｌｔｈｙ　ａｎｄ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｍｏ１　Ｓｃｉ，２０１６，２７，１８（１）：４１．　的表达水平显著降低（图２）。本课题研究结果提示ＤＨＯＤＨ　减少所引起的线粒体功能障碍可导致成骨细胞成熟过程停滞，　而这有可能导致米勒综合征异常骨骼发育。　综上所述，本研究证明了ＤＨＯＤＨ缺失导致线粒体功能　障碍，从而影响成骨细胞的细胞增殖和成骨基因表达。这提示　（收稿Ｉｔ期：２０１６－１１－１１修回日期：２０１７－＝０１－２２）　《重庆医学》对临床研究论文医学伦理学要求　凡投本刊的涉及人的生物医学研究论文，作者应说明所在用的试验程序是否经过伦理审查委员会（单位性的、地区性的　或国家性的）评估，注明批准号。涉及患者（受试者）的应签订知情同意书。　《重庆医学》编辑部