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贵州医药２００７年２月第３１卷第２期 · ｌＯ７ · 胃癌组织中ｐ５３基因突变及蛋白 表达的研究 贵阳医学院病理教研室（５５０００４）于燕妮 陈 杨 胡 军 方 艺 樊 毓 摘 要 目的探讨胃癌组织中ｐ５３基因第５～８外显子突变率及ｐ５３蛋白的表达。方法应 用聚合酶链反应一单链构象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）和银染技术，对３Ｏ例胃癌石蜡包埋组织中ｐ５３基 因第５～８外显子突变率进行检测；同时应用免疫组织化学Ｅｎｖｉｓｉｏｎ二步法检测胃癌组织中ｐ５３的 表达水平。结果３Ｏ例胃癌石蜡标本中有ｌ１例发生ｐ５３基因的突变，突变率为３６．６７ 。病理组织学 观察胃癌中乳头状腺癌／管状腺癌（分化较好）１６例，低分化腺癌／印戒细胞癌（分化较差）１４例。ｐ５３ 蛋白随胃癌的分化程度降低而增加，阳性表达率递增（Ｐ＜Ｏ．０５）。结论胃癌组织中ｐ５３基因突变及 ｐ５３蛋白高表达在胃癌的发生中有重要的作用及意义。从石蜡包埋组织中提取ＤＮＡ进行分子生物 学检测适用于肿瘤研究。 关键词 胃癌 ｐ５３基因 聚合酶链反应一单链构象多态性分析 第５～８外显子突变 Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐ５３ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐ５３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｙｕ Ｙａｎｎｉ， ＣｈｅＴ＂ｌ Ｙａｎｇ。Ｈ“Ｊｕｎ，ｅｔａ１．ＧｕｉｙａｎｇＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００４ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｐ５３ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｉｎ ｅｘｏｎｓ ５—８ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＰＣＲ－ＳＳＣＰ ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔＯ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ５，６，７，８ ｅｘｏｎｓ ｏｆ ｐ５３ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔＯ ｔｈｅ ｅｘ－ ｐｒｅｓｓｌｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｉｎ ３０ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｌ１ ｃａｓｅｓ ｏｕｔ ｏｆ ３０ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ（３６．６７ ）．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｐ５３ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（Ｐ＜ ０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｐ５３ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐｌａｙ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． 、 Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｇｅｎｅ ｐ５３ ＰＣＲ－ＳＳＣＰ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｉｎ ｅｘｏｎｓ ５～８ 中图分类号：Ｒ７３５．２。Ｒ７３０．２３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００—７４４Ｘ（２００７）０２—０１０７—０３ 胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一。对胃癌病因学 研究和探讨，特别是对ｐ５３基因及其蛋白表达的研究， 是当今肿瘤研究的热点课题。野生型ｐ５３基因是一种 抑癌基因，当发生缺失或突变后可使细胞无限地生长， 是肿瘤增生异常活跃的因素之一，其失活对肿瘤的形 成有着重要作用［１］。在人类肿瘤中，ｐ５３基因失活最常 见的形式是点突变，９０ 以上的ｐ５３基因突变发生在４ 个高度进化的保守区，即位于ｐ５３基因第５～８外显子 上［引。本研究应用Ｐ（］Ｒ－ＳＳＣＰ和银染技术对３０例胃 癌石蜡包埋组织中ｐ５３基因第５～８外显子突变情况 进行检测；同时应用免疫组化法对胃癌ｐ５３蛋白的表 达进行研究，探讨ｐ５３基因突变及ｐ５３蛋白表达在胃癌 中的作用及地位，为该肿瘤的预防、早期诊断、治疗及 预后提供实验依据。 ｌ材料和方法 收集贵阳医学院附属医院病理科２００２～２００３ 年确诊的胃癌组织标本３０例，每例经我院病理科高 年资医师复诊确认。按ＷＨＯ胃癌组织学分类标 准，根据分化程度将３０例胃癌分为分化较好（乳头 状腺癌／管状腺癌）和分化较差（低分区腺癌／印戒细 胞癌）两组。所有组织经１０ 中性固定， 常规石蜡包埋，切片。 １．２石蜡包埋组织ＤＮＡ提取 用切片机切片，每片组织厚８ ｍ，取６～８片放 人Ｅｐ管中，按文献［３］方法抽提ＤＮＡ。先加ｌｍｌ 二甲苯３７℃水浴３０ｍｉｎ脱蜡，重复１次后再加入 ｌｍｌ无水乙醇漂洗去除二甲苯，重复１次，加人３０ｕｌ 丙酮６０℃水浴１ ｈ去除残存乙醇，加人２８０ｐ－１蛋白 酶Ｋ消化液（蛋白酶Ｋ消化液：５０ｍｍｏｌ／Ｉ Ｔｒｉｓ— ＨＣＩ ｐＨ８．０；ｌｍｍｏｌ／Ｉ ＥＤＴＡ ｐＨ ９．０；０．５ １．１胃癌组织标本 注：本课题系贵州省基金资助项目（￥２００４—１０） Ｔｗｅｅｎ一１００；酚一氯仿：饱和重蒸酚加人等体积氯仿／ 异戊醇；混匀）和２０／ｚｌ蛋白酶Ｋ。３７℃水浴放置１８ ｈ，加入３００ｔ￣ｌ ＴＥ缓冲液，离心后取上清，用相同体 维普资讯 http://www.cqvip.com
· １０８· 积氯仿一异戊醇抽提后，加入十分之一体积ＮａＡｃ和 １．２体积异丙醇沉淀，７０ 乙醇洗涤去除杂质，晾干 后溶于适量的ＴＥ中，－－２０℃保存备用。 １．３ ＰＣＲ扩增 按文献［４，５］的序列设计引物（表１），由上海生 物公司合成，ｄＮＴＰ购于上海生物公司，Ｔａｇ酶购自 北京天为时代科技有限公司。 表１ ｐ５３基因第５～８外显子的４对引物 ＰＣＲ反应体系２５ ｌ。各反应成分的浓度为： ＤＮＡ模板２００ｎｇ，ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、 ｄＧＴＰ）各２００￣ｍｏｌ／Ｉ ；上、下引物浓度为 ０．４￣ｍｏｌ／Ｉ ，ＰＣＲ缓冲液；Ｔａｇ酶１ 。反应参数 为：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ；５５℃３０ｓ；７２℃ ｌｍｉｍ３０次循环后７２℃延伸５ｍｉｎ。以１．５ 琼脂 糖凝胶对扩增产物进行鉴定。 １．４ ＳＳＣＰ分析 配制非变性８ 聚丙烯酰胺（２９：１）制成 １ ｍｍ厚的凝胶，置于１×ＴＢＥ普通垂直板电泳槽 中，取ＰＣＲ产物８ ｌ，加１０ ｌ去离子甲酰胺及２ ｌ 溴酚蓝液，９８℃变性１０ｍｉｎ后立即置于冰浴中骤 冷，取变性样品加入凝胶孔内。１ ５Ｖ／ｃｍ电压下 电泳。 １．５银染色 取出凝胶作银染色。先用１０ 乙醇固定 １０ｍｉｎ，双蒸水洗１次，ｌｍｉｎ；转入１ 中氧化 ４ｍｉｎ，双蒸水洗２次，每次ｌｍｉｎ；再转入 ０．０１２ｍｏｌ／Ｌ银溶液中２０ｍｉｎ，双蒸水洗３次，每 次ｌｍｉｎ。最后转入０．０２８ｍｏｌ／Ｉ 无水碳酸钠和 ０．０１９ 甲醛中显色至条带清晰，１０ 冰醋酸终止还 原反应５ｍｉｎ。双蒸水浸泡，记录结果并照相。 １．６免疫组织化学 切片脱蜡进水，高温高压热修复，采用Ｅｎｖｉｓｉｏｎ 二步法，常规免疫组织化学染色。ｐ５３为单克隆抗 体（丹麦Ｄａｋｏ公司产品），工作稀释浓度为１：８０。 每批染色设ＰＢＳ代替一抗的阴性对照，以已知的胃 癌阳性染色切片做阳性对照。 １．７结果判定 １．７．１ ＳＳＣＰ结果判断 Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｍａｌ，２００７，Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．２ 参考文献［６］每次ＳＳＣＰ电泳都加正常胃组织 扩增产物对照，若待测样品与正常相比出现条带的 增加、减少或位置移动说明该样品存在基因突变。 每个样本至少进行２次检测，以保证存在泳动变位 结果的重复性。 １．７．２免疫组化染色阳性结果判定 ｐ５３阳性细胞多位于粘膜固有层腺体，阳性定 位除细胞核表达较强，少数病例还可见胞浆呈弥漫 性染色。ｐ５３蛋白阳性判断标准，阴性（一）＜５ ， 未见阳性细胞；阳性（＋）＜２５ ；阳性（＋＋）２５ ～ ５０ ；阳性（＋＋＋）＞５０ 。 ２结果 ２．１ ｐ５３基因第５～８外显子的ＰＣＲ扩增产物 扩增片段长度分别为：第５外显子为２１４ｂｐ，第 ６外显子为１４４ｂｐ，第７外显子为１３３ｂｐ，第８外显 子为１６６ｂｐ。见图１。 图ｌ ｐ５３基因第５～８外显子的ＰＣＲ扩增产物 １为外显子５扩增片段；２为ＤＮＡ分子量标准；３为外显子６扩 增片段；４为外显子７扩增片段；５为外显子８扩增片段 ２．２胃癌石蜡标本中ｐ５３基因第５～８外显子突变 情况 ３０例胃癌石蜡包埋组织中ｐ５３基因第５～８外 显子突变检测结果：３０例胃癌石蜡标本中有ｌ１例 发生ｐ５３基因的突变，突变率为３６．６７ 。其中３ 例突变位于外显子５，２例突变位于外显子６，２例突 变位于外显子７，４例突变位于外显子８（图２）。ｌ１ 例ｐ５３基因突变的胃癌类型是：乳头状腺癌２例，管 状腺癌２例，低分化腺癌５例，印戒细胞癌２例。 ｅ 挚 ≤ ｉ一 羲 、薅 女 ≈ 薅 —毒 图２胃癌ｐ５３基因外显子５～８的银染ＳＳＣＰ分析 ｌ～３为外显子６，其中１是正常条带，２、３分别为两例突变条 带；４～６为外显子５，其中４是正常条带，５、６分别为两例突变条带； ７～９为外显子７，其中７是正常条带，８、９分别为两例突变条带；１０ ～ｌ２为外显子８，其中ｌＯ是正常条带，ｌｌ、ｌ２分别为两例突变条带 维普资讯 http://www.cqvip.com
贵州医药２００７年２月第３１卷第２期 ２．３免疫组化检测ｐ５３的表达 ｐ５３蛋白在分化较好（ｇＬ头状腺癌／管状腺癌） 及分化较差（低分化腺癌／印戒细胞癌）两组胃癌组 织中的表达。见表２。 表２胃癌ｐ５３蛋白的阳性表达（ ） 表２结果显示：ｐ５３蛋白在分化较差组的阳性 表达明显增加，分化较好的胃癌与分化较差的胃癌 两组相比，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。 ３讨论 肿瘤的发生是多步骤演变导致基因突变积累的 结果。抑癌基因失活在肿瘤发生中所起的作用比癌 基因活化更为重要，ｐ５３基因是肿瘤抑制基因，正常 情况下，ｐ５３在生物体内对细胞增殖起负调节作 用，野生型ｐ５３基因一旦发生突变将导致细胞的恶 性增殖。ｐ５３基因是胃癌组织中最常发生变异的肿 瘤抑制基因，ｐ５３基因突变可能是细胞生物学行为 改变的标志之一［１ ］。人类ｐ５３基因定位于染色 体１７Ｐ上［３］，包括１６—２０ｋｂ，由１１个外显子和１０个 内含子组成。存在５个高度进化的保守区，其中４ 个定位于外显子第５～８上，也是人类肿瘤中ｐ５３基 因突变的“热点区”。研究［２ ］表明，ｐ５３基因失活在 胃癌中可能起着重要作用，而ｐ５３基因失活中最常 见的形式是突变。因此，探讨胃癌中ｐ５３基因第５ ～８外显子突变率对于认识胃癌的发生、发展有着 重要发病学意义。 本研究应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和银染技术对３０例胃 癌石蜡包埋组织中ｐ５３基因第５～８外显子进行检 测，有１１例存在ｐ５３基因突变，突变率为３６．６７ ， 此结果与文献［５］报道的结果相似，提示ｐ５３基因突 变在胃癌中有重要的作用及意义。同时应用ｐ５３抗 体检测到绝大部分是突变型ｐ５３蛋白。本组结果表 明：胃癌组织中，分化较差组（低分区腺癌／印戒细胞 癌）ｐ５３阳性表达率明显高于分化较好组（乳头状 腺癌／管状腺癌）（Ｐ＜０．０５），提示ｐ５３蛋白在分化 较差组胃癌组织中阳性过表达，则胃癌多恶性和预 后差。ｐ５３蛋白缺失或突变可能主要发生于胃癌的 晚期阶段，是反映胃癌生物学行为和预测的重要参 数。 ＳＳＣＰ分析作为一种简便、快速可行的方法广 · １０９ · 泛应用于研究基因突变，其原理基于碱基序列改变， 从而影响单链ＤＮＡ构象，在电泳时因构象差异造 成迁移率不同的条带来检测是否有突变。ＰＣＲ－ＳＳ— ＣＰ分析可用于筛选小于４００￣５００ｂｐ的ＤＮＡ片断 的突变情况。特别适用于大样本的研究调查和临床 诊断实验［引。结合银染技术，不仅操作简便、省时， 又避免了放射性同位素的污染。 虽然ＰＣＲ技术可以扩增数个拷贝的模板 ＤＮＡ，但在临床研究基因分析中从固定和 石蜡包埋组织中抽提ＤＮＡ较困难，主要是因为组 织固定时间过长、ＤＮＡ双螺旋由于强大的交联作用 而降解［９］，使ＤＮＡ的质和量均不够之缘故。为此， 本研究采用近期的石蜡包埋组织，按文献［３３方法从 石蜡包埋组织抽提ＤＮＡ，并按已发表序列设计引 物，成功扩增出目的片断，该结果与以往从培养肿瘤 细胞中抽提ＤＮＡ扩增的结果相似，此研究为临床 病理研究肿瘤开辟了新的途径。 参考文献 １ Ｓｔｅｅｌｅ ＲＪＣ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＡＭ，Ｈａｌｌ ＰＡ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｐ５３ ｔｕｍｏｕｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ［－Ｊ］．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ， １９９８，８５：１ ４６０－１ ４６７． ２ Ｌｅｖｉｎｅ ＡＪ，Ｍｏｍａｎｄ Ｊ，Ｆｉｎｌａｙ ＣＡ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｐ５３ ｔｕｍｏｕｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅｌ－Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３１５：４５３． ３白春英，郝俊海，白海花．石蜡包埋组织中ＤＮＡ的提取 ｌ－Ｊ］．生物学杂志，２００２，１９（３）：３５—３６． ４ Ｉｃｈｉｋａｗａ Ａ，Ｈｏｔｔａ Ｔ，Ｔａｋａｇｉ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐ５３ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔＯ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｌ，Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，１９９２，７９（１０）：２ ７０１—２ ７０７． ５李乐翔，谢云青，郭福榕．应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染技术分析 胃癌ｐ５３基因的点突变ｌ－Ｊ］．实用癌症杂志，２００２，１７（１）： ２３—２５． ６丁守怡，郭成浩，肖德刚，等．ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术检测原发性 胃腺癌石蜡标本ｐ５３第七外显子基因突变的初步研究 －ｉＪ］．肿瘤防治杂志，２００２，７（２）：１２０－１２２． ７ Ｔ Ｍａｔｏｚａｋｉ，Ｃ Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｔ Ｓｕｚｕｋｉ，ｅｔ ａ１．ｐ５３ ｇｅｎｅ ｍｕ— ｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ：ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｐ５３ ｂｕｔ ｎｏｔ ｍｕｔａｎｔ ｐ５３ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓｌ，Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓａｅｒｃｈ，１９９２，５２（１６）：４ ３３５－４ ３４１． ８ Ｊｏｒｄａｎｏｖａ Ａ，Ｋａｌａｙｄｉｉｅｖａ Ｌ，Ｓａｖｏｙ Ａ，ｅｔ ａ１．ＳＳＣＰ Ａ— ｎａｌｙｓｉｓ：Ａ ｂｌｉｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｉｒａｌ，ｌＪ］．Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ， ｌ９９７，１０：６５－７０． ９ Ｒｅｎ ＺＰ，Ｓａｌｌｓｔｒｏｍ Ｊ，Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎｇ ＤＮＡ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ＰＣＲ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｍｉｅｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｆｉｘｅｄ ａｎｄ ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ［Ｊ］． Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，６８：２１５—２１８．